腎陽虛對骨關節炎大鼠軟骨退變的影響

宋威江　周麗　杜夢夢　羅靜　陶慶文

【摘 要】目的：探索腎陽虛對骨關節炎（osteoarthritis，OA）大鼠軟骨退變的影響。方法：將18只雄性SD大鼠隨機分為正常組、OA組、OA腎陽虛組，每組6只。Hulth法建立OA模型，Hulth法加腺嘌呤灌胃建立OA腎陽虛模型。通過腎陽虛癥狀、體征評價表評價腎陽虛證候，光鏡觀察大鼠膝關節軟骨組織病理學改變，OARSI和Mankin's評分評價軟骨退變程度。結果：OA組和OA腎陽虛組大鼠均存在腎陽虛證候表現，且腎陽虛癥狀、體征積分均較正常組高（P = 0.002），其中OA腎陽虛組大鼠較OA組大鼠積分更高（P = 0.004）。OA組大鼠OARSI評分為4～6分、Mankin's評分屬于OA早中期;OA腎陽虛組大鼠OARSI評分為12～16分、Mankin's評分屬于OA中晚期，組間比較，差異有統計學意義（P < 0.01）。結論：OA大鼠存在腎陽虛證候表現，且腎陽虛明顯加重OA大鼠的軟骨退變程度。

【關鍵詞】 骨關節炎;腎陽虛;軟骨退變;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To explore the effects of kidney yang deficiency on cartilage degeneration in osteoarthritis（OA）rats.Methods：Eighteen male SD rats were randomly divided into a normal group，an OA group and an OA kidney yang deficiency group，6 rats in each.The OA models were established by the Hulth method，and the kidney yang deficiency models were established by adenine gavage administration based on the Hulth method.The syndromes of kidney yang deficiency were evaluated by the symptom and sign evaluation table for kidney yang deficiency.The pathological changes of cartilage tissue were observed under the light microscope.The degree of cartilage degeneration was evaluated by OARSI and Mankin's scores.Results：Both of the OA group and the OA kidney yang deficiency group had the kidney yang deficiency syndrome，and the scores of kidney yang deficiency symptoms and signs was higher than those of the normal group（P = 0.002），among which the score of the OA kidney yang deficiency group was higher than that of the OA group（P = 0.004）.The OARSI scores of the rats in the OA group were from 4 to 6.Mankin's score was in the early and middle stages of OA，and the OARSI scores of the rats in the OA kidney yang deficiency group was from 12 to 16，and the Mankin's score was in the middle and late stages of OA.The difference between groups was statistically significant（P < 0.01）.Conclusion：OA rats have the symptoms of kidney yang deficiency，and kidney yang deficiency can aggravate the degree of cartilage degeneration in OA rats.

【Keywords】 osteoarthritis;kidney yang deficiency;cartilage degeneration;rats

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨退變為主要病理特點的慢性、進展性關節疾病，多累及負重和易磨損關節，臨床以關節疼痛、功能障礙、畸形為特點[1]。據統計，我國40歲以上人群OA患病率為46.3%，70歲以上人群超過60%，嚴重影響國民健康[2-3]。盡管西醫學飛速發展，截至目前OA仍缺乏理想的西藥治療[1]。OA屬中醫學“骨痹”范疇，現代中醫名家普遍認為腎陽虛是本病的主要病機，并以“補腎”立法治之[4-5];臨床實踐和大量研究表明，溫補腎陽中藥治療OA具有療效[6-7]，但腎陽虛與OA的關系尚缺乏研究證實。本研究通過比較正常大鼠、OA大鼠、OA腎陽虛大鼠在腎陽虛證候和關節軟骨退變方面的差異，探索腎陽虛對OA軟骨退變的影響，以期為OA的補腎治療提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康無特定病原體（SPF）級SD雄性大鼠18只，6周齡，體質量190～210 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2016-0006。在SPF級條件下分籠飼養于北京中日友好醫院臨床醫學研究所實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK（京）2016-0043，室溫20～26 ℃，相對濕度40%～60%，每日12 h光照與12 h黑夜循環，大鼠飼料和飲用水均經高壓滅菌處理，定期更換墊料。

1.2 主要儀器設備與試劑 光學顯微鏡（上海徠卡儀器有限公司）;生物組織石蠟包埋機、病理切片機、組織脫水機、生物組織攤烤片機（櫻花病理儀器株式會社）;酶標檢測儀（美國Molecular Devices）;福爾馬林、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、乙醇（北京九州柏林科技生物有限公司）;蘇木素染液、伊紅染液、乙二胺四乙酸、磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京Solabio生物科技有限公司）;腺嘌呤（SIGMA）。

2 方 法

2.1 分組與造模 適應性喂養1周后，采用隨機數字表法將大鼠分為正常組、OA組、OA腎陽虛組，每組6只。

①Hulth法建立OA模型：OA組應用質量分數為10%的水合氯醛4 mL·kg-1腹腔麻醉大鼠，橫向切開膝關節皮膚，橫向切開髕韌帶，再切斷內側副韌帶，暴露膝關節關節腔，取下內側半月板，再切斷前后交叉韌帶，逐層縫合髕韌帶和關節外皮，術后3 d予青霉素腹腔注射預防感染。5周后造模成功。

②Hulth法加腺嘌呤灌胃法建立OA腎陽虛模型：OA腎陽虛組大鼠采用Hulth法造模1周后開始腺嘌呤灌胃，每只大鼠用腺嘌呤150 mg·kg-1·d-1灌胃，灌胃4周后造模成功。正常組給予等體積生理鹽水灌胃。

2.2 標本采集與處理 分離各組大鼠術側膝關節，保持關節完整性，置于體積分數為10%的中性福爾馬林固定72 h后，EDTA脫鈣液脫鈣，每7天更換一次脫鈣液，直至骨質變軟時停止脫鈣。常規脫水，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），常規脫蠟，沖洗，蘇木素染色，用體積分數為1%的鹽酸乙醇分化30 s，伊紅染色，自來水沖洗，逐級乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性樹膠封片。

2.3 腎陽虛證候評價 按照腎陽虛動物模型癥狀、體征評價表[8]進行證候評價，包括7個條目：

①毛發失去光澤;②弓背、蜷縮;③倦怠、精神萎靡;④自主活動減少;⑤反應遲鈍;⑥飲食減少;⑦大便稀溏。無表現評為0分，有表現評為1分。每只大鼠每周評價1次。由2名中醫師獨立進行腎陽虛證候評價，意見不一致的地方通過咨詢第3名中醫師解決。

2.4 組織病理學評價 光鏡觀察各組大鼠膝關節軟骨結構、細胞、基質及潮線情況。（1）根據OARSI評分對關節軟骨的退變程度進行分級、分期、評分[9]。①OARSI分級：0級，淺表層完整，軟骨細胞形態、排列正常;1級，淺表層水腫和（或）輕度纖維化，軟骨細胞增殖、肥大;2級，淺表層連續性中斷，軟骨上1/3區域染色淡，過渡層深染，細胞排列紊亂、增殖、肥大、簇集;3級，過渡層和輻射層上層出現裂隙，軟骨下2/3區域染色淡，新生膠原形成，軟骨細胞肥大、凋亡，裂隙周圍見軟骨細胞簇集;4級，軟骨淺表層分層、剝脫，過渡層和輻射層基質丟失、上層囊腫形成;5級，軟骨下骨暴露、象牙化，可伴纖維軟骨、血管翳生成;6級，軟骨下骨重塑，伴纖維軟骨或骨性組織修復，骨贅形成。②OARSI分期：0期，未見OA活動;1期，OA受累表面長度 < 表面總長度的10%;2期，OA受累表面長度占表面總長度的10%～<25%;3期，OA受累表面長度占表面總長度的25%～50%;4期，OA受累表面長度 > 表面總長度的50%。③OARSI評分 = 分級×分期。（2）按照Mankin's評分標準，根據軟骨結構完整性、細胞數量、基質染色、潮線完整性對關節軟骨退變程度進行評分并分期：0～6分為OA早期，7～9分為OA中期，10～14分為OA晚期[10]。①軟骨結構：正常，0分;表面不規則，1分;血管翳形成且表面不規則，2分;裂隙達軟骨過渡層，3分;裂隙達軟骨輻射層，4分;裂隙達軟骨鈣化層，5分;完全破壞，6分。②軟骨細胞：正常，0分;彌漫性細胞增加，1分;局部細胞數量增加，2分;細胞數量減少，3分。③基質染色：正常，0分;輕度減少，1分;中度減少，2分;重度減少，3分;無著色，4分。④潮線：完整，0分;不完整、有血管穿過，1分。

2.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，組間比較不服從正態分布或方差不齊采用Mann-Whitney非參數檢驗，假設檢驗采用雙側檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 腎陽虛證候評價 OA造模1周后，模型大鼠的癥狀、體征開始出現變化。造模成功后，正常組大鼠癥狀、體征較造模前無明顯變化，積分為0分;OA組大鼠腎陽虛癥狀、體征積分較正常組高，差異有統計學意義（P = 0.002）;OA腎陽虛組大鼠積分較OA組高，差異有統計學意義（P = 0.004）。見表1。

3.2 膝關節軟骨組織病理 光鏡下可見：①正常組大鼠膝關節軟骨淺表層完整，軟骨細胞形態、排列正常，基質染色均勻，潮線清晰完整;②OA組大鼠膝關節軟骨淺表層連續性中斷，軟骨細胞增殖、肥大、簇集，部分基質淡染，潮線不完整;③OA腎陽虛組大鼠膝關節軟骨淺表層大范圍纖維化，縱形裂隙深入到輻射層，軟骨細胞肥大、凋亡明顯，基質染色淡，部分基質丟失，潮線破壞。見圖1。

3.3 OARSI評分 膝關節軟骨組織OARSI分級：正常組為0級，OA組為2級，OA腎陽虛組為4級。OARSI分期：正常組為0期，OA組為2～3期，OA腎陽虛組為3～4期。OA組、OA腎陽虛組OARSI評分與正常組比較，差異有統計學意義（P = 0.002或P = 0.001）;OA腎陽虛組OARSI評分較OA組更高，差異有統計學意義（P = 0.002）。見表2。

3.4 Mankin's評分 膝關節軟骨組織Mankin's評分：正常組大鼠為0分;OA組大鼠為4～7分，屬于OA早中期;OA腎陽虛組大鼠為7～11分，屬于OA中晚期。OA組、OA腎陽虛組Mankin's評分與正常組比較，差異有統計學意義（P = 0.002）;OA腎陽虛組Mankin's評分較OA組更高，差異有統計學意義（P = 0.006）。見表3。

4 討 論

本研究通過比較各組大鼠的膝關節軟骨發現：①OA大鼠存在腎陽虛證候表現，程度較OA腎陽虛大鼠輕;②OA大鼠膝關節軟骨OARSI評分較OA腎陽虛大鼠低;OA大鼠膝關節軟骨Mankin's評分屬早中期，而OA腎陽虛大鼠屬中晚期。上述結果表明，OA大鼠存在腎陽虛的證候表現，且腎陽虛程度越重，關節軟骨退變越重。

OA腎陽虛病證結合復合模型的成功構建是開展本研究的基礎。理想的OA腎陽虛病證結合復合模型應具備OA組織病理學特點和中醫腎陽虛的證候特點。課題組前期比較了Hulth法加去勢法、Hulth法加腺嘌呤灌胃法、Hulth法加D半乳糖皮下注射法構建OA腎陽虛病證結合復合模型的差異，以Mankin's評分評價軟骨組織病理學表現，從腎陽虛癥狀、體征和三大激素軸（甲狀腺軸、性腺軸、腎上腺軸）的激素水平評價腎陽虛表現，發現Hulth法加腺嘌呤灌胃法造模后，大鼠腎陽虛和OA組織病理學表現最典型，因此，該方法是構建OA腎陽虛病證結合復合模型的最適宜方法[11]，保證了本研究結果的可靠性。

OA患病率高，可致畸和致殘，西醫學缺乏理想的藥物治療[1]。中醫學認為，“腎主骨”“腎主生長發育”，《素問·上古天真論篇》中詳細論述了人體腎氣與筋骨發育的關系，隨著年齡增長，腎氣漸盛，筋骨漸壯，而伴隨衰老，腎氣漸衰，筋骨亦漸衰，說明腎陽虛伴隨著筋骨衰退。流行病學調查發現，伴隨衰老，OA患病率增加[3]，提示OA患者多伴有腎陽虛證候，溫補腎陽可能有益于延緩OA的發生和進展?，F代中醫名家普遍以“補腎”立法治療OA，如國醫大師周仲瑛、全國風濕病中醫專家閻小萍等[4-6]，隨之形成了一系列補腎為主治療OA的中藥復方制劑，如強骨膠囊、骨痹顆粒、骨痹通方等[12-14]。課題組前期多中心隨機對照臨床研究發現，骨痹通方與鹽酸氨基葡萄糖比較，能顯著降低膝OA患者的西安大略和麥克馬斯特大學評分與關節疼痛視覺模擬評分法評分，并能減少止痛藥的使用[15]。然而，腎陽虛與OA的關系一直處于中醫理論和名家經驗階段，缺乏研究證實，一定程度上限制了補腎中藥治療OA的推廣應用。本研究從動物實驗層面證明OA大鼠存在腎陽虛證候表現，且腎陽虛能顯著加重OA大鼠的關節軟骨退變，提示腎陽虛是OA的主要病因，可以為未來臨床以“補腎”立法治療OA及相關研究提供實驗依據。

參考文獻

[1] HUNTER DJ，BIERMA-ZEINSTRA S.Osteoarthritis[J].Lancet，2019，393（10182）：1745-1759.

[2] 中華醫學會骨科學分會關節外科學組.骨關節炎診療指南（2018版）[J].中華骨科雜志，2018，38（12）：705-715.

[3] 薛慶云，王坤正，裴福興，等.中國40歲以上人群原發性骨關節炎患病狀況調查[J].中華骨科雜志，2015，35（12）：1206-1212.

[4] 周學平，方樑，張碩，等.國醫大師周仲瑛從腎虛絡痹辨治骨關節炎經驗述要[J].中華中醫藥雜志，2018，33（3）：948-951.

[5] 李楠，林昌松，姜玉寶.補腎化瘀法治療骨關節炎經驗[J].中醫雜志，2016，57（23）：2047-2048.

[6] 馬驍，楊舒，閻小萍，等.基于“腎虛”的膝骨關節炎“寒熱為綱”辨治臨床研究[J].中華中醫藥雜志，2015，30（12）：4264-4267.

[7] 蘇志超，杜鑫，閆華瓊，等.獨活寄生湯聯合膏摩法治療膝骨性關節炎風寒濕痹兼肝腎虧虛證35例臨床觀察[J].中醫雜志，2020，61（3）：217-221.

[8] 陳英華，歐陽軼強，孫琪，等.腎陽虛證動物模型規范化研究中診斷指標選擇的初步探討[J].中國中醫基礎醫學雜志，2003，9（10）：26-30.

[9] PRITZKER KP，GAY S，JIMENEZ SA，et al.Osteoarthritis cartilage histopathology：grading and staging[J].Osteoarthritis Cartilage，2006，14（1）：13-29.

[10] BOBINAC D，SPANJOL J，ZORICIC S，et al.Changes in articular cartilage and subchondral bone histomor phometry in osteoarthritic knee joints in humans[J].Bone，2003，32（3）：284-290.

[11] 陳穎穎，羅莎，杜夢夢，等.不同造模方法對骨關節炎腎陽虛證動物模型相關指標的影響[J].世界中西醫結合雜志，2018，13（12）：1677-1680.

[12] 阮競鋒，王一.強骨膠囊聯合腹針治療膝骨關節炎療效觀察[J].風濕病與關節炎，2013，2（4）：49-51.

[13] 劉慧，周玲玲，周聰，等.骨痹顆粒對骨關節炎相關炎性反應的作用及機制[J].中華中醫藥雜志，2015，30（12）：4466-4468.

[14] 陶慶文，徐愿，王建明，等.骨痹通方治療膝骨關節炎的臨床研究[J].風濕病與關節炎，2012，1（4）：11-14.

[15] TAO QW，XU Y，JIN DE，et al.Clinical efficacy and safety of Gubitong Recipe（骨痹通方）in treating osteoarthritis of knee joint[J].Chin J Integr Med，2009，15（6）：458-461.

收稿日期：2020-02-28;修回日期：2020-04-19