基于網絡藥理學探討牛膝治療骨關節炎的作用機制

范夢夢　范儀銘　李峰　郭珈宜

【摘 要】目的：運用網絡藥理學探討牛膝治療骨關節炎有效成分的作用靶點及通路。方法：通過TCMSP數據庫挖掘牛膝的有效成分并預測其作用靶點，利用GeneCards、OMIM等數據庫篩選骨關節炎的靶標，運用Cytoscape軟件構建藥物-活性成分-靶點的關系網絡，通過STRING數據庫構建靶點蛋白-蛋白相互作用網絡，并對關鍵靶點的生物功能注釋及通路進行分析。結果：預測得到20個牛膝治療骨關節炎的有效成分和47個有效靶點，并推測其作用機制可能與細胞凋亡信號通路、多種物種-細胞凋亡信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、白細胞介素-17信號通路等有關，且前列腺素G/H合成酶1、雄激素受體、雌激素受體1 等靶點基因可能起關鍵性作用。結論：牛膝有效成分可能通過調控炎癥因子及細胞凋亡等藥理作用發揮治療骨關節炎的作用。

【關鍵詞】 骨關節炎;牛膝;網絡藥理學;靶點

【ABSTRACT】Objective：To explore the target and pathway of active ingredients from Niuxi（Radix Achyranthis Bidentatae）for osteoarthritis by network pharmacology.Methods：TCMSP database was used to mine the effective components of Niuxi and predict their target.Databases such as Genecards and OMIM were used to screen the targets of osteoarthritis.The relationship network of drug，active components and target was constructed by using software Cytoscape .The interaction network of target protein was constructed by STRING database.The biological function annotation and pathway of key targets were analyzed.Results：Twenty active components and 47 effective targets of Niuxi for osteoarthritis were predicted，and the mechanism of action might be related to apoptosis signaling pathway，multi species apoptosis signaling pathway，tumor necrosis factor signaling pathway，interleukin-17 signaling pathway，and prostaglandin G/H synthetase 1，androgen receptor，estrogen receptor 1and other target genes may play a key role.Conclusion：The effective components of Niuxi may play a role in the treatment of osteoarthritis by regulating inflammatory factors and apoptosis.

【Keywords】 osteoarthritis;Niuxi;network pharmacology;target

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是臨床常見的好發于中老年群體的慢性退行性關節疾病，病理表現主要為關節軟骨退變損傷、骨贅形成、滑膜炎癥性反應、關節間隙變窄及軟骨細胞凋亡。OA發病機制至今尚不明確，其病因涉及多種因素，如年齡、激素、肥胖、遺傳、工作性質等[1]。目前，65歲以上人群約一半飽受OA的困擾，致殘率可高達53%[2]。網絡藥理學這一概念最早于2017年由HOPKINS等提出，其通過構建“藥物-靶點-疾病”網絡，從而全面認識藥物活性成分與疾病之間的作用關系，為藥物研發提供創新性策略[3]。網絡藥理學的整體性、系統性特點與中醫理論辨證論治、整體觀及方劑的配伍原則相統一[4]。本研究在網絡藥理學理論指導下，研究牛膝治療OA的作用機制，構建藥物-成分-靶點網絡，旨在為OA的臨床治療及實驗研究提供理論支持。

1 方 法

1.1 牛膝活性成分的篩選 檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php），對牛膝所含成分數據進行挖掘，通過評價藥物化學成分在體內的過程，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，篩選牛膝的活性成分[5]。

1.2 相關作用靶點的獲取與收集 利用TCMSP數據庫中的“靶點預測”功能，預測牛膝入血活性成分作用靶點，并利用perl語言（http：//www.perl.org/）校正預測靶點名稱。檢索GeneCards數據庫（http：//www.genecards.org/）和OMIM數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim），收集與OA相關的靶點，合并2個數據庫檢索后獲取的數據，排重后利用R語言（https：//www.r-project.org/）將與牛膝有效成分相關的作用靶點和疾病靶點取交集，獲得牛膝治療OA的靶點，并制作韋恩圖。

1.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建 使用Cytoscape 3.7.1軟件（http：//www.cytoscape.org）構建牛膝活性成分-作用靶點網絡。網絡中的節點（Node）代表藥物、有效成分與關鍵靶點;邊（Edge）代表藥物-成分、成分-靶點、靶點-疾病的連接。整個網絡構建展示了藥物-成分-靶點-疾病之間的關系，深入解讀牛膝治療OA的作用機制。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網絡（PPI）的構建與分析 運用STRING數據庫（https：//string-db.org）預測蛋白質間的相互作用。STRING數據庫采用不同方式獲取預測結果并進行評分，分值越高，PPI網絡結果的置信度越高。本研究利用STRING數據庫的“Multiple Proteins”功能，并設定“物種”為人類（Homo Sapiens），將牛膝治療OA的關鍵靶點輸入STRING數據庫進行檢索，設置分值 > 0.4，便可構建PPI網絡。

1.5 關鍵靶點生物功能注釋及通路分析 本研究運用perl語言工具將牛膝治療OA的關鍵靶點名稱轉換為entrez ID，并以R語言為平臺，通過Bioconductor、ClusterProfiler等工具以P < 0.05為條件，進行富集分析，并將富集結果可視化。Bioconductor是以R語言為平臺，并為高通量基因組數據提供多種分析和理解方法的分析工具，其提供了含人類在內的19個物種的GO注釋信息[6]。ClusterProfiler也是基因數據分析的R語言工具，其利用Bioconductor提供的GO注釋信息和KEGG pathway數據庫（http：//rest.keggjp/link/hsa/pathway）進行信號通路富集分析。

2 結 果

2.1 牛膝活性成分的篩選 運用TCMSP數據庫檢索得到牛膝有效成分176個，以OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18為篩選條件，獲得牛膝的潛在活性成分20個。見表1。

2.2 牛膝入血活性成分治療OA的潛在作用靶點預測 通過TCMSP數據庫中的靶點預測篩選最終得到牛膝入血活性成分的作用靶點100個;通過GeneCards平臺和OMIM平臺收集OA相關靶點，合并去重后最終獲得疾病靶點1301個。運用R語言“VennDiagram”程序包將牛膝和OA靶點取交集，最終得到47個交集靶點，繪制韋恩圖。見圖1。

2.3 牛膝治療OA的藥物-成分-靶點網絡構建 將牛膝活性成分及其治療OA的作用靶點信息導入Cytoscape 3.7.0軟件，構建藥物-成分-靶點網絡。見圖2。圖中黃色點代表牛膝的藥物活性成分，綠色點代表牛膝治療OA的作用靶點，邊代表活性成分和作用靶點之間的聯系，圖中結果提示槲皮素（Quercetin）、黃芩素（Baicalein）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、前列腺素G/H合成酶1（PTGS1）、雄激素受體（AR）、雌激素受體1（ESR1）等是牛膝治療OA的關鍵成分或靶點。圖中同一靶點可對應多個活性成分，說明牛膝治療OA發揮著多成分、多靶點的優勢。

2.4 牛膝治療OA的關鍵靶點PPI網絡分析 運用STRING數據庫，輸入牛膝入血活性成分治療OA的靶點，設定置信度評分> 0.4，并將游離于網絡之外的蛋白予以剔除，最終得到PPI網絡。見圖3。

網絡中的“節點”代表靶點，每個節點的連接節點越多，說明該靶點在網絡中處于核心地位。運用R語言繪制網絡中關鍵靶點的條形圖，見圖4。

結果表明，白細胞介素-6（IL-6）、CASP3、VEGFA、MAPK8、MYC等蛋白的鄰接基因較多，說明這些蛋白在網絡中占有重要的核心地位。

2.5 生物功能及通路分析 運用R語言對疾病與藥物靶點47個交集基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析結果顯示，牛膝治療OA的關鍵靶點富集顯著表現的前10個生物學功能為DNA結合轉錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性（12個靶點），核受體活性（6個靶點），轉錄因子活性，直接配體調控序列特異性DNA結合（6個靶點），RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合（7個靶點），類固醇激素受體活性（5個靶點），激活轉錄因子結合（5個靶點），轉錄輔因子結合（4個靶點），半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡過程（3個靶點），E-box binding（4個靶點），組蛋白脫乙酰酶結合（5個靶點）。結果表明，牛膝有效成分能夠通過調控多種生物學途徑發揮治療OA的作用。見圖5。

KEGG通路富集得出104條結果，其中102條通路的P < 0.01。以P值和通路富集基因的數量作為篩選條件，取前20個通路進行分析，結果顯示，基因明顯富集在細胞凋亡信號通路、多種物種-細胞凋亡信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、IL-17信號通路、泌乳素信號通路等通路上，見圖6。

3 討 論

OA屬中醫學“痹證”范疇。OA產生的病因外與風、寒、濕邪侵襲，痹阻經絡，氣血運行失常有關;內因為肝腎虧虛，筋骨失養。本虛標實是導致OA產生的重要病機。在治療上以補肝腎強筋骨、溫經通絡為主，兼以祛風散寒除濕。牛膝為四大懷藥之一，具有補肝腎、強筋骨、逐瘀通經的作用，是臨床治療OA的常用中藥材。在中醫藥治療OA的相關文獻中，牛膝的使用頻次居第2位[7]。

本研究檢索TCMSP數據庫，以OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，得到20個牛膝的潛在活性成分，經與OA疾病靶點對接，得到11個活性化學成分，且均有相關文獻進行報道，分別為海棠果素E[8]、黃芩苷[9]、黃連堿[10]、黃連素[11]、漢黃芩素[12]、黃藤素[13]、山柰酚[14]、槲皮素[15]、β-谷甾醇[16]、谷甾醇[17]、豆甾烯醇[18]。藥物-成分-靶點網絡圖中可看出，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇是牛膝治療OA的關鍵成分。其中，槲皮素又名槲皮黃素，是黃酮類化合物，其能夠抑制炎癥遞質的釋放，減少神經元細胞凋亡[19]，抑制基質金屬蛋白酶的表達，清除氧自由基，有效減少氧化應激引起的各種不良反應[20]。山柰酚能夠抑制核轉錄因子-κB信號通路相關蛋白的活化和炎癥介質的釋放，進而發揮抗炎作用[21]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，在抗炎、抑制腫瘤、調節免疫等方面發揮著重要作用，β-谷甾醇的攝入量與慢性病發生率有一定的關系[22]。

OA發病機制復雜，疾病的產生與氧化應激反應、激素水平、炎癥因子的大量釋放等因素密切相關。本研究共預測到47個牛膝治療OA的關鍵靶點，PTGS1、AR、ESR1是藥物-成分-靶點的核心靶點。PTGS又稱為環氧合酶（COX），其分為2個亞型，即COX-1和COX-2。有研究表明，自身免疫性疾病和炎癥性疾病與PTGS有密切的關系[23]。AR是主要存在于睪丸間質和支持細胞內的核受體，能有效抑制氧化應激反應，調節由血管緊張素Ⅱ引發的血管收縮，且與一氧化氮的生成有著密切關系[24]。ESR1信號通路介導能夠促使雌激素發揮作用，增加骨膜的骨形成，減少破骨細胞的數量，抑制骨小梁和皮質內骨表面的骨吸收[25]。

本研究將檢索到的靶點運用GO和KEGG富集化分析，得到與OA密切相關的通路，如細胞凋亡信號通路、多種物種-細胞凋亡信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。這些通路與OA的產生關系密切。

本研究結果表明，牛膝治療OA有著多成分、多靶點、多通路的特點，對所預測出來的靶點及通路需要進行科學驗證。綜上所述，本研究運用網絡藥理學方法研究牛膝治療OA的機制，闡述了多靶點和多成分之間錯綜復雜的網絡關系，為進一步系統研究牛膝治療OA的臨床應用及研究提供理論依據。

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收稿日期：2020-01-29;修回日期：2020-03-29