木霉菌合成銀納米粒子條件的優化及其對甜瓜尖孢鐮刀菌抑制作用

姚薇，曲明星，崔曉慧，夏潤璽，劉限

沈陽農業大學 生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866

引起甜瓜枯萎病的尖孢鐮刀菌是既可侵染植物又可在土壤內生存的兼性寄生真菌[1]，一般從植物根部入侵，在不同時期均可使甜瓜枯萎致死，從而造成甜瓜產量和品質下降[2]。目前農業上通常采用化學農藥防治枯萎病，但長期過量施用化學農藥將嚴重污染土壤，造成土壤生態環境失衡和病原菌產生抗藥性[3]。因此，生產上急需環境友好型且不易使病原菌產生抗藥性的生物殺菌劑。納米粒子由于其在大小、分散程度和形狀等方面的特性表現出新的優點，在醫學、農業和食品等領域引起廣大學者的關注[4]。許多金屬納米粒子對病毒、細菌和真菌等微生物都具有較強的殺菌活性[5]，其中AgNPs是被廣泛研究利用的金屬納米粒子，可以作為抗微生物劑、抗癌劑、光催化劑、抗氧化劑和殺蚊劑[6]。AgNPs的合成因物理和化學法的生產成本高和高毒性物質的副作用而轉向生物合成。以細菌、真菌等微生物代謝物和植物提取物為還原劑和穩定劑生物合成AgNPs，具有綠色環保和高安全性的特點[7-10]，其中對金屬具有高抗性和高聚合能力的真菌[11]能夠分泌細胞外酶而廣泛用于AgNPs的合成。目前已有多種木霉菌用于合成AgNPs，主要有棘孢木霉Trichoderma asperellum[12]、綠色木霉T.viride[13]、哈茨木霉T.harzianum[14]、蓋木斯木霉T.gamsiiIPT853[15]和長枝木霉T.longibrachiatum[16]，但不同木霉菌合成AgNPs的條件不同[17-18]。

本研究以橘綠木霉T.citrinoviride和毛簇木霉T.velutinous發酵液為還原劑和穩定劑合成AgNPs，以UV-vis光譜表征特征探究不同合成條件對不同木霉菌合成AgNPs影響，以期明確木霉菌合成AgNPs的最適條件。同時研究不同木霉菌合成的AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑菌活性，為農用新型藥劑的開發和甜瓜枯萎病的防控奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

橘綠木霉T.citrinoviride和毛簇木霉T.velutinous，分離于柞樹根系，保存于沈陽農業大學生物科學技術學院實驗室。

尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum分離于甜瓜枯萎病根系，保存于植物保護學院實驗室。

1.2 供試培養基

PDA固體培養基：將馬鈴薯去皮洗凈，稱量200 g并切塊，加入蒸餾水煮沸20–30 min，用紗布過濾后，將其濾液倒入鍋中加熱，加入瓊脂條20 g，不斷攪拌，待瓊脂條完全溶解后加入葡萄糖20 g，攪拌均勻，稍冷卻后再添加蒸餾水至1 000 mL，分裝于錐形瓶中，滅菌后備用。

PDB培養基：制備方法同上，培養基中不加入瓊脂。

1.3 試劑

硝酸銀 (分析純AR)，西隴科學股份有限公司；氫氧化鈉 (分析純AR)，西隴科學股份有限公司；鹽酸 (分析純AR)，西隴科學股份有限公司。

1.4 銀納米粒子的合成

木霉菌在PDA培養基上活化后轉移到PDB培養基中，在28 ℃、150 r/min下振蕩培養3 d。然后用無菌Whatman濾紙1號過濾菌絲，收集濾液 (使用此濾液合成AgNPs方法命名為CL法)和木霉菌絲。木霉菌絲 (10 g) 用無菌去離子水洗滌2次以除去培養基，然后加入100 mL無菌去離子水中，振蕩培養3 d，使用無菌Whatman濾紙1號過濾收集濾液 (使用此濾液合成AgNPs方法命名為CW法)。將200 μL AgNO3(1 mol/L) 加入100 mL濾液 (CL法或CW法) 中并在光照或黑暗條件下反應5 d。離心 (12 991×g，30 min)收集合成的AgNPs，用無菌水洗滌2次，再用75%乙醇洗滌1次。合成的AgNPs自然干燥后稱重，備用。

1.5 銀納米粒子合成條件的優化

1.5.1 不同反應條件對合成銀納米粒子的影響

分別設置靜置暗反應、靜置光照、振蕩暗反應、振蕩光照4個反應條件，每12 h進行紫外可見光分光光度計全波長 (300–800 nm) 掃描，綜合分析利于AgNPs合成的條件。

1.5.2 底物AgNO3濃度對合成銀納米粒子的影響

根據前面試驗結果，設置100 mL反應液中AgNO3(1 mol/L) 的終濃度分別為1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L，于靜置光照條件下反應24 h，分析反應液中AgNO3濃度對AgNPs合成的影響。

1.5.3 不同pH對合成銀納米粒子的影響

根據前面試驗結果，反應液的pH分別調整為3、5、7、9，AgNO3濃度為2.0 mmol/L，于靜置光照條件下反應24 h，分析pH對AgNPs合成的影響。

1.5.4 不同溫度對合成銀納米粒子的影響

根據前面試驗結果，將反應液 (pH：7；AgNO3濃度為2.0 mmol/L) 分別于25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃，靜置光照條件下反應24 h，分析溫度對AgNPs合成的影響。

1.6 AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制作用

AgNPs沉淀于滅菌水中用超聲波細胞破碎儀將其充分破碎分散后，制成AgNPs水溶液，然后加入PDA培養基中，使AgNPs最終濃度分別為0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L。然后倒入培養皿中，晾干后接鐮刀菌菌餅，28 ℃下倒置暗培養7 d，測量鐮刀菌菌落直徑，計算AgNPs對鐮刀菌生長的抑制作用。每個處理重復3次。

1.7 數據處理

試驗數據使用軟件Excel (Office 2010) 整理和方差分析。

2 結果與分析

2.1 四種反應條件下橘綠木霉T.citrinoviride CW法合成AgNPs的比較

橘綠木霉在靜置暗反應、靜置光照、振蕩暗反應、振蕩光照4個反應條件下，采用CW法合成AgNPs，合成過程中每12 h進行紫外可見光分光光度計全波長掃描。掃描結果表明，在靜置暗培養條件下從0–72 h、在400–500 nm范圍內無寬吸收峰且波長位置幾乎重合，且反應液顏色一直呈淡黃色 (圖1A)。在靜置光照條件下培養12 h后，438 nm處出現吸收峰，72 h達到最大值，且吸收峰位置基本保持不變，該特征吸收峰與文獻中報道的納米銀的UV-vis光譜吸收峰是一致的；反應液顏色0 h時呈淡黃色，12 h變成棕色，72 h時顏色變深至黑褐色 (圖1B)。振蕩暗反應和振蕩光照在0–48 h全波長掃描結果波形位置基本一致，60–72 h在400–500 nm之間吸收峰位置變高，反應液在0–48 h顏色幾乎無變化，60–72 h變為深黃色 (圖1C和1D)。因此，T.citrinovirideCW法合成AgNPs過程中靜置光照的反應條件是最好的，吸光度達到2.6 。

圖1 4種反應條件對橘綠木霉CW法合成AgNPs的比較Fig.1 Effect of 4 reaction parameters on synthesis of AgNPs by T.citrinoviride with CW method.(A) Standing and dark.(B) Standing and light.(C) Shaking and dark.(D) Shaking and light.

2.2 四種反應條件下毛簇木霉T.velutinous CW法合成AgNPs的比較

毛簇木霉在4種反應條件下CW法合成AgNPs情況與橘綠木霉基本一致，也是在靜置光照條件下合成效果最好。研究發現，靜置光照條件下培養12 h后，438 nm處出現吸收峰，72 h達到最大值，且吸收峰位置基本保持不變 (圖2B)。因此，T.velutinousCW法合成AgNPs中靜置光照反應條件下合成AgNPs效果最佳，吸光度達到2.7。

圖2 4種反應條件對毛簇木霉CW法合成AgNPs的比較 (A：靜置暗反應；B：靜置光照；C：振蕩暗反應；D：振蕩光照)Fig.2 Effect of 4 reaction parameters on synthesis of AgNPs by T.velutinous with CW method.(A) Standing and dark.(B) Standing and light.(C) Shaking and dark.(D) Shaking and light.

2.3 四種反應條件下橘綠木霉T.citrinoviride CL法合成AgNPs的比較

在4種反應條件下，橘綠木霉T.citrinoviride合成AgNPs CL法明顯好于CW法，4種反應條件下顏色變化明顯，都有AgNPs的生成。其中靜置光照條件下反應顏色均在12 h開始變化，72 h時達到黑褐色，合成量明顯增加 (圖3)。結果顯示，靜置光照條件下培養12 h后，437 nm處出現吸收峰，72 h達到最大值，為10.2。根據反應顏色變化及紫外掃描得出結論T.citrinovirideCL法在靜置光照條件下合成AgNPs合成效果好。

圖3 4種反應條件對橘綠木霉CL法合成AgNPs的比較 (A：靜置暗反應；B：靜置光照；C：振蕩暗反應；D：振蕩光照)Fig.3 Effect of 4 reaction parameters on synthesis of AgNPs by T.citrinoviride with CL method.(A) Standing and dark.(B) Standing and light.(C) Shaking and dark.(D) Shaking and light.

2.4 四種反應條件下毛簇木霉T.velutinous CL法合成AgNPs的比較

毛簇木霉CL法合成AgNPs與T.citrinovirideCL法合成AgNPs基本一致，但最佳合成條件下吸收峰在24 h達到最高，為3.2，隨著時間的延長吸收峰降低，推測可能是木霉菌發酵液中的部分還原性成分被破壞，發酵液的還原能力降低，AgNPs合成量降低。反應顏色均在12 h開始變化 (圖4)，且光照培養顏色變化均明顯好于暗培養條件。根據反應顏色變化及紫外掃描得出結論：T.velutinousCL法合成AgNPs在采用靜置光照條件合成AgNPs時合成效果最好。

圖4 4種反應條件對毛簇木霉CL法合成AgNPs的比較Fig.4 Effect of 4 reaction parameters on synthesis of AgNPs by T.velutinous with CL method.(A) Standing and dark.(B) Standing and light.(C) Shaking and dark.(D) Shaking and light.

綜合兩種木霉菌在兩種合成方法和4種反應條件下合成AgNPs的情況，木霉菌合成AgNPs以靜置光照下合成效果最佳，橘綠木霉的合成量高于毛簇木霉的。

2.5 硝酸銀濃度對木霉菌發酵液合成AgNPs的影響

反應液中AgNO3濃度對兩種木霉菌發酵液合成AgNPs的影響見圖5。反應液中AgNO3濃度為1.0 mmol/L時，兩種木霉菌都幾乎無吸收峰出現，而其他兩種濃度均在440 nm處出現吸收峰，說明合成了AgNPs。反應液中AgNO3的濃度為2.0 mmol/L時，合成AgNPs的特征吸收峰的峰值最高。橘綠木霉合成AgNPs的量高于毛簇木霉。

圖5 反應液中AgNO3濃度對木霉菌合成AgNPs的影響Fig.5 Effect of AgNO3 concentration in the reaction solution on the synthesis of AgNPs by Trichoderma strains.

2.6 pH對木霉菌發酵液合成AgNPs的影響

不同pH對兩種木霉菌發酵液合成AgNPs的影響見圖6。當pH為3時，合成AgNPs吸收峰峰值較低，說明此條件下合成能力較弱；pH為7時，合成AgNPs的特征吸收峰的峰值最高，說明合成能力最好。在酸性條件下，合成的納米銀的特征吸收峰發生紅移(圖6)。當pH為5–9時，兩種木霉菌發酵液合成AgNPs的量基本沒有影響。

圖6 pH對木霉菌合成AgNPs的影響Fig.6 Effect of pH on the synthesis of AgNPs by Trichoderma strains.

2.7 溫度對木霉菌發酵液合成AgNPs的影響

不同溫度對兩種木霉菌合成AgNPs的影響見圖7。45 ℃和55 ℃的特征吸收峰的峰值較高，55 ℃形成的是寬峰，說明AgNPs的粒徑較大；45 ℃形成的是窄峰，說明納米銀的粒徑較小。與45 ℃的特征吸收峰相比，其他條件下吸收峰發生紅移。因此，木霉菌合成AgNPs的最適反應溫度為45 ℃。溫度對兩種木霉菌發酵液合成AgNPs的量基本沒有影響。

圖7 溫度對木霉菌發酵液合成AgNPs的影響Fig.7 Effect of temperature on the synthesis of AgNPs by Trichoderma strains.

2.8 AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制作用

兩種木霉菌均采用CL法合成AgNPs溶液，設置了0、25、50、100、200 mg/L五種不同的濃度，觀察對尖孢鐮刀菌的抑制效果。木霉菌合成的AgNPs對鐮刀菌都有抑制作用，在相同濃度下，兩種木霉菌合成的AgNPs對尖孢鐮刀菌沒有顯著性差異。不同濃度的AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制情況也有所不同。隨著濃度的增加，抑制效果越好。兩種木霉菌合成AgNPs都是在200 mg/L時抑制效果最好 (表1)。

3 討論

近年來，隨著綠色環保概念的普及，與傳統的化學、物理合成法相比，生物合成銀納米粒子的備受關注。許多生物已經被用于合成金屬納米顆粒[19]，而微生物尤其是真菌可產生大量生物活性成分，這些成分在生物合成AgNPs過程中常被用作輔助劑、封端劑和穩定劑，從而更有利于金屬納米粒子的合成[20]。本試驗使用T.citrinoviride和T.velutinous合成AgNPs，通過改變反應合成條件，發現T.citrinoviride和T.velutinous發酵液均可用于合成AgNPs，合成最適條件為CL法靜置光照培養，反應液中AgNO3濃度為2.0 mmol/L，pH為7，反應溫度為45 ℃。AgNPs的尺寸、形狀、形態、組成和介電環境決定了AgNPs的顏色，因此可借助UV-vis識別AgNPs的形成[21]。木霉菌發酵液和無色的AgNO3溶液于靜置光照下發生顏色變化，證實了AgNPs的合成[22]。隨著反應時間的增加，反應顏色加深，表明AgNPs的濃度增加，說明AgNPs的形成與反應時間成正比[23]。所有合成的AgNPs都在400–500 nm的波長處被吸收，所形成的AgNPs電鏡觀察大多為球形或扭曲的球形 (另有論文發表)，這與Dauthal和Mukhopadhyay的推測結果基本一致[24]。微生物發酵液合成AgNPs的條件，不同文獻報道不甚相同，Elgorban等[13]利用綠色木霉T.viride在靜置暗培養條件下合成AgNPs；張杰等[25]利用鉤狀木霉T.hamatun在150 r/min暗反應合成AgNPs；Omran等[17]利用長枝木霉T.longibrachiatum合成AgNPs時發現，在振蕩的條件下攪拌速度的增加會引起反應混合液發生湍流，這可能會造成AgNPs產率的降低；而Gade等[26]利用側耳屬Pleurotusspp.合成AgNPs時發現，在有陽光的情況下，Ag+的還原迅速發生，而在黑暗時需24 h才能完全還原。本試驗中，在設置的4個反應條件中 (靜置暗反應、靜置光照、振蕩暗反應、振蕩光照)，靜置光照合成效果較好，由此看出AgNPs合成條件與不同的微生物有關；采取兩種合成方法 (CL法、CW法)，發現CL法合成AgNPs的效果更好，可能是由于CL法的發酵液濾液中含有更多的木霉菌合成的各種有機物質，從而有利于納米銀的合成。據文獻報道，金屬硝酸鹽可以通過暴露于陽光下產生的熱量而分解，而真菌發酵液中的芳香族化合物通過光活化，芳香族化合物和蛋白質作為封端劑啟動金屬納米粒子的合成，真菌發酵液的光敏芳香族化合物向Ag+提供電子還原以形成具有封端劑的金屬納米粒子[27]。此外，隨著底物濃度從1.0 mmol/L增加到3.0 mmol/L，AgNPs的SPR峰略紅移，這可能是在更高的底物濃度 (3.0 mmol/L)下形成了較大尺寸AgNPs。其中，使用2.0 mmol/L合成的AgNPs表現出更好的穩定性。在反應體系中，酸性pH條件下AgNPs的SPR峰發生紅移，這表明AgNPs的粒徑變大。在酸性pH條件下，生物代謝物主要以陽離子形式存在，如NH3+-R-COOH。質子化的胺基之間存在靜電排斥，但是NH3+基團傾向于吸附到銀納米顆粒的表面，從而降低了NH3+基團之間的靜電斥力，因此，它決定了-COOH基團之間氫鍵的優勢，并導致納米粒子的聚集，因此AgNPs發生聚集導致粒徑變大。而在中性pH和堿性pH條件下，生物代謝物組分帶負電，從而將電子轉移到Ag+最終還原Ag+導致形成了小尺寸的AgNPs[28]。隨溫度升高AgNPs濃度顯著升高，而在高溫 (45 ℃、55 ℃)下，SPR峰略紅移。隨著樣品溫度的升高，納米顆粒的體積由于熱膨脹而增加，溫度的升高會導致納米粒子中自由電子的濃度降低，并導致SPR峰的紅移[29]。

表1 AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制率Table 1 Inhibitory rate of silver nanoparticles against F.oxysporum

木霉菌發酵液合成的AgNPs能夠抑制尖孢鐮刀菌的生長，兩種木霉菌合成的AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制沒有顯著性差異；不同濃度的AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制性存在顯著性差異，且隨著濃度的不斷增大，抑制效果越好。納米銀對金黃色葡萄球菌[30]、大腸桿菌[30]、植物病原真菌[31](灰霉病菌、尖孢鐮刀菌、白皮腐霉) 等都有抑制作用，說明AgNPs具有廣譜抑菌作用。后續研究還需明確AgNPs對甜瓜枯萎病的防治效果和是否對甜瓜生長有影響。

4 結論

兩種木霉菌發酵液均可合成AgNPs，合成AgNPs的最適條件：CL法靜置光照培養，底物AgNO3濃度為2.0 mmol/L，pH為7，反應溫度為45 ℃。UV-Vis顯示AgNPs表面等離子體共振發生在437 nm處，出現最大吸收峰。兩種木霉菌生物合成AgNPs對尖孢鐮刀菌都具有抑制效果，濃度越高，抑制效果越好。