腸癌患者腸道菌群分析及攜帶β-葡萄糖醛酸酶基因特征

嚴斌斌，戴桂花，王 彬，馬琳琳，包學英，李明成

(1.北華大學醫學技術學院，吉林 吉林 132013；2.北華大學附屬醫院，吉林 吉林 132011)

腸癌是發生于結腸和直腸的惡性腫瘤[1]，腸癌的發生與遺傳因素、社會環境、飲食習慣及結構等密切相關，高齡、體型肥胖、抗菌藥物濫用等均是腸癌的高危因素[2].癌前病變有一定的可能和概率轉變為癌癥.腺瘤(包括鋸齒狀腺瘤等)及腺瘤病(包括家族性、非家族性腺瘤性息肉病)、炎癥性腸病(包括克羅恩病、潰瘍性結腸炎等)均可視為腸癌的癌前病變.隨著中國居民的生活節奏加快及高脂飲食等習慣[3]，腸癌患者數量顯著上升，早期篩查具有現實價值.由于腸道微生物在營養代謝及免疫調節上具有舉足輕重的作用，因此，被認為與大腸癌的發生有直接的關聯[4].近來越來越多的證據[5]表明：腸道菌群結構的紊亂與腸癌的發展及預后有密不可分的相關性.β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase，GUS)可分解、游離和活化腸道內無毒物質，導致致癌物在腸道內蓄積增多，提高了罹患腸癌的風險.

采集腸癌前病變、腸癌患者及健康人糞便樣品，選取大腸埃希菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌為代表的需氧菌和乳酸桿菌、消化球菌、雙歧桿菌為代表的厭氧菌對腸道菌群和β-葡萄糖醛酸酶基因特征進行分析，探討腸癌前病變及腸癌早期腸道菌群變化和早期診斷的生物學指標[6].

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2017年9月—2017年12月北華大學附屬醫院腸癌患者3例，其中，男2例(直腸癌，51歲；結腸癌，47歲)，女1例(直腸癌，63歲)，平均年齡(53.6±8.3)歲，中位年齡51歲；腸癌前病變患者2例，其中，男1例(家族性腺瘤息肉病，46歲)，女1例(管狀腺瘤，52歲)，平均年齡(49.0±4.2)歲，中位年齡49歲.以上患者均經腸鏡及病理檢查明確診斷，且于采集樣品前2周未使用抗菌藥物、微生物活菌制劑及聚乙二醇等瀉劑[7].同期收集4例北華大學醫學技術學院健康師生作為對照組，其中，男2例(49歲、26歲)，女2例(53歲、46歲)，平均年齡(43.5±12.0)歲，中位年齡47.5歲.健康對照組排除慢性消化道病史，并未使用上述藥物.本研究均得到研究對象同意并簽署知情同意書.

1.2 試 劑

2×Taq PCR Master Mix(批號：N20630)、D2000 DNA Marker(批號：MD114)、pGM-T cloning Kit(批號：03707)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(批號：04211)、質粒小提試劑盒(批號：03914)(北京天根生化科技有限公司)；瓊脂糖(批號：89310510)、細菌培養基(批號：20151221)(青島高科園海博生物技術有限公司).

1.3 儀 器

BP110S型電子分析天平(上海精科儀器廠)；Bugbox-SM型厭氧工作站(北京隆福佳生物科技有限公司)；ECT811型PCR擴增儀(廣州東勝生物科技有限公司)；JY-SPC型電泳槽、DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；BSC-1600ⅡB2型生物安全柜(浙江蘇凈凈化設備有限公司)；GHP-9050型隔水式恒溫培養箱(上海聯科儀器設備有限公司)；ZF-90型暗箱式紫外投射儀(上海顧村電光儀器廠).

1.4 腸道細菌的分離培養及計數

將0.1 g準確稱量的新鮮糞便放入1.5 mL的滅菌EP管內，加入0.9 mL的滅菌生理鹽水后充分震蕩混勻，然后進行濃度梯度倍比稀釋.取相應濃度梯度樣品10 μL，在生物安全柜內滴加到相應的培養基內，用L棒均勻涂布整個平板后，按照參考文獻[5]方法進行細菌培養并計數(見表1).

表1 腸道菌群培養條件Tab.1 Culture conditions of intestinal flora

1.5 提取腸癌前病變患者大腸埃希菌DNA

參照文獻[8]，應用水煮法提取DNA，于150 μL滅菌雙蒸水中挑入單個菌落充分混勻，置于100 ℃水中煮沸10 min，并迅速將其轉至-20 ℃冷卻，然后12 000 r/min離心10 min，取上清于-20 ℃保存.

1.6 目的基因片段PCR擴增

從GeneBank數據庫下載β-葡萄糖醛酸酶基因uidA(Acession No.S69414.1)的全部序列，利用軟件Primer 5.0設計特異性引物.上游引物：5′G GGCAA CAA GCC GAA AGA 3′；下游引物：5′CC ATACCTGTTCACCGACGA3′(由上海生工生物工程股份有限公司合成)，目的基因片段為309 bp.

PCR反應體系：2×Taq PCR Master Mix 12.0 μL，上、下游引物及DNA模板各1.0 μL，補足滅菌ddH2O至25 μL，陰性對照為滅菌ddH2O.PCR循環參數：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環30次，72 ℃延伸5 min.取6 μL PCR產物與1 μL 6×loading Buffer充分混勻后，1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光線投射儀下觀察并拍照.

1.7 重組質粒構建

腸癌前病變患者大腸埃希菌PCR產物經普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，提純后使用pGM-T cloning Kit進行轉化及藍白斑篩選，挑取陽性菌落過夜，培養后用質粒小提試劑盒提取重組質粒.

1.8 重組質粒測序及比對

提取腸癌前病變患者大腸埃希菌重組質粒，與GenBank中登錄號為S69414.1的uidA基因序列進行比對.

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 腸道菌群構成

對腸癌前病變、腸癌患者及健康人的腸道菌群進行培養及計數，腸癌前病變、腸癌患者大腸埃希菌、腸球菌及酵母菌顯著增加，乳酸桿菌和雙歧桿菌明顯減低，需氧和厭氧菌比例與數量呈顛倒狀態.對3組實驗結果進行方差分析，大腸埃希菌、酵母菌、腸球菌以及厭氧菌的雙歧桿菌、乳酸桿菌在3組間的差異具有統計學意義(P<0.05).各組兩兩比較，腸癌前病變患者與健康人比較差異具有統計學意義(P<0.05)，而腸癌前病變與腸癌患者比較差異無統計學意義(P>0.05).見表2.

2.2 目的基因片段PCR擴增結果

將2例腸癌前病變患者大腸埃希菌水煮DNA進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在309 bp處均出現清晰單一的目的基因片段條帶.見圖1.

腸道菌群腸癌組(n=3)腸癌前病變組(n=2)健康對照組(n=4)P大腸埃希菌11.89±0.4811.37±0.339.01±1.550.033酵母菌11.10±1.538.95±3.175.43±1.690.024金黃色葡萄球菌3.12±0.914.23±0.532.88±1.190.361腸球菌10.21±1.099.69±0.936.78±1.710.039雙歧桿菌8.40±0.477.90±0.6210.70±0.450.010乳酸桿菌7.78±0.239.00±1.0410.36±1.220.036消化球菌10.62±0.6510.14±1.3310.75±1.230.815

2.3 質粒測序及分析比對結果

經深圳華大基因科技有限公司所得測序結果經GenBank中BLAST分析見圖2.腸癌前病變患者大腸埃希菌重組質粒目的基因片段與登記號S69414.1中β-葡萄糖醛酸酶序列比對：Score=566 bits(306)，Expect=2×10-165，Identities=308/309(同源性為99%)，Gaps=0/309(0%)，第1497位置G突變成A.

3 討 論

人體腸道中的細菌種類多樣，存在結腸內的細菌超過400種.腸道微生物與人體在正常狀態下經過物質代謝與能量交換等方式進行精密的代謝合作[9].當腸道內環境發生改變，微生態系統失衡，通常具有致病作用[10].細菌培養結果顯示：腸癌、腸癌前病變患者大腸埃希菌、腸球菌及酵母菌增多，乳酸桿菌和雙歧桿菌減低，腸道菌群結構改變表現為有益菌的減少和有害菌的增加，機會致病菌與益生菌比例反轉.腸癌由非典型增生性腺瘤惡性轉化往往需要10 a以上[11]，同時有證據[12]表明：其腸道內pH及短鏈脂肪酸隨時間延長分別增高和減少，因此，腸道菌群改變是癌變的始發因素而非繼發改變，腸道菌群變化作為微生態指標可用于預估患者腸道生態系統狀態以及發生腸癌的可能性.腸道環境中需氧菌顯著增多可導致硫化氫、次級膽汁酸、乙醛、偶氮氧化甲烷(AOM)、烷基化合物在內的化學致癌劑、誘變劑和胞外過氧化物、氧自由基等負性代謝在腸道大量積累，從而損傷腸道細胞基因及染色體穩定，導致異型性增生的腸道細胞增多，加快了腸癌前病變向惡性腫瘤的轉化.而益生菌如乳酸桿菌及其代謝產物等可以誘導產生包括IL-12、TNF-α等多種細胞因子阻止病原體入侵腸道，減少慢性炎癥對腸道細胞的長期不良刺激.雙歧桿菌可通過減少bcl-2的表達而增加bax基因的表達，誘導癌細胞凋亡[12]，從而預防和抑制腫瘤的發生.

在細胞發生癌變時β-葡萄糖醛酸酶的活性明顯增高，并在癌周結締組織水解蛋白多糖及糖蛋白，監測其活性變化能夠輔助診斷消化系統腫瘤[13].β-葡萄糖醛酸酶對大腸埃希菌具有一定的特異性，在細菌增殖過程中可引起GUS在腸道環境內積聚.戴起寶等[14]通過測定腸癌組癌灶黏膜細菌β-葡萄糖醛酸酶活性，發現其活性顯著高于對照組；KIM等[15]研究表明：結腸癌患者糞便中β-葡萄糖醛酸酶活性比正常對照組高1.7倍.測序結果顯示：腸癌前病變患者大腸埃希菌重組質?；蛐蛄信cGenBank(Acession No.S69414.1)uidA基因序列比較同源性為99%，第1497位置G突變成A.同時本課題組前期工作表明：腸癌患者大腸埃希菌GUS基因第1141和1148位A缺失，第1149位和第1158位的A分別突變為T和G[16]，這可能導致GUS活性改變并產生更多致癌物質.因此，大腸埃希菌uidA基因突變會增加癌前病變患者的癌變風險，可通過檢測uidA基因mRNA轉錄及酶的蛋白表達來進一步驗證.

本實驗主要研究癌前病變、腸癌患者和健康人的腸道菌群改變情況，從而進一步明確了腸癌前病變患者腸道菌群的早期變化及uidA基因突變，為預測腸癌前病變患者癌變發生概率，尋找腸癌的早期篩查和確診指標提供了新的思路及理論依據.