不同溫度及乙醇含量對生料醋醅中醋酸菌產酸能力的影響

李陽 張麗珍 楊埔 張一中

摘要：從正常發酵的生料醋醅中分離、篩選得到一株醋酸菌，通過形態學、16S rDNA基因序列分析，確定菌株為巴氏醋桿菌。菌株發酵過程中，改變發酵溫度和初始乙醇添加量，研究其對有機酸種類和含量的影響，為評價食醋品質提供參考依據。利用高效液相色譜檢測樣品，檢測到的有機酸有草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸，最高含量分別是2.5 mg/100 mL，5.0 mg/mL，3.4 mg/100 mL，0.17 mg/mL。在37，42，47 ℃這3個溫度下最適宜有機酸生成的乙醇添加量分別是4%，6%，2%，最利于醋酸菌發酵的溫度是42 ℃。

關鍵詞：生料醋醅;醋酸菌;溫度;乙醇含量;有機酸

中圖分類號：TS201.3????? 文獻標志碼：A??? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.02.002

Effect of Different Temperature and Ethanol Content on Acid Production Ability of Acetic Acid Bacteria in Raw Material Vinegar

LI Yang1，*ZHANG Lizhen1，YANG Pu1，ZHANG Yizhong2

（1. School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan，Shanxi 030006，China;

2. Institute of Sorghum Research，Shanxi Academy of Agriculture Sciences，Jinzhong，Shanxi 030600，China）

Abstract：A strain of Acetobacter was isolated and screened from the normal fermented raw material vinegar，and the strain was identified as Acetobacter pasteurianus by morphological and 16S rDNA gene sequence analysis. During the fermentation of the strain，the fermentation temperature and initial ethanol addition were adjusted to studied its effect on the type and content of organic acid，which provided a reference for evaluating the quality of vinegar. The samples were detected by high performance liquid chromatography. The organic acids detected were oxalic acid，lactic acid，acetic acid and citric acid，and the highest content were 2.5 mg/100 mL，5.0 mg/mL，3.4 mg/100 mL，and 0.17 mg/mL respectively. The optimum ethanol content at different temperatures 37，42，47 ℃ was 4%，6%，2%. The optimum fermentation temperature for acetic acid bacteria was 42 ℃.

Key words：raw vinegar;acetic acid bacteria;temperature;ethanol addition;organic acid

食醋在春秋時期就有記載，是一種常見的酸味調味料，通常以糧食為主料，加入大曲后進行糖化、酒精發酵、醋酸發酵[1]，再加水淋制最終得到成品醋的過程。發酵過程中微生物種類眾多、成分豐富，含有多種維生素、氨基酸[2]，還有黃酮、酚酸[3]等有益成分，在降低血壓[4]、緩解疲勞[5]等方面有顯著效果，因此人們對食醋的需求也越來越高。傳統食醋的釀造原料需要經過蒸煮，生料醋的特色就是原料與發酵劑混合后直接發酵[6]，釀造過程中反應類型更多、更復雜[7]，因此口感與傳統食醋相比更加醇厚。

醋酸菌在釀造過程中扮演重要角色，負責將乙醇氧化成乙酸[8-9]，過高的乙醇含量會抑制微生物的生長[10]，不適的溫度會破壞發酵酶類的活性[11]，因此探究合適的初始乙醇含量和發酵溫度尤為重要。關于生料醋醅中醋酸菌的研究相對較少，可以參考的數據不多。陳洋[12]從浙江等醋廠中篩選出了耐10%乙醇、耐40 ℃高溫的醋酸桿菌，經16S rDNA鑒定為巴氏醋桿菌，并研究了其耐乙醇機制。胡宇豪等人[13]對耐12%乙醇的巴氏醋桿菌的培養基進行了優化，得出在常規培養基中加入5.5%乙醇、0.5%乙酸時，產酸量可以最大程度地提高。李文等人[14]從腐爛的獼猴桃中篩選出一株醋酸菌，耐40 ℃高溫、耐12%高醇，經研究可使產酸量提高30.54%。向進樂等人[15]從木瓜醋中檢測出了草酸、酒石酸等10種有機酸，且醋酸含量最高。目前，生料醋的研究尚存在較多空白，比如有機酸的類型、高溫、高醇對其發酵性能的影響等。

試驗以自然發酵的生料醋醅為樣品，分離純化出醋酸菌菌種，再通過菌落形態特征、產酸定性試驗、16S rDNA序列的分析對其進行鑒定。發酵過程中添加不同含量的乙醇，研究不同溫度下對醋酸菌產酸特性的影響，研究成果可以作為優化醋酸發酵的數據參考。

1?? 材料與方法

1.1?? 材料與試劑

1.1.1?? 培養基

基礎培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨4 g/L，瓊脂12 g/L，1.6%溴甲酚紫4 000 μL，滅菌后加入3%無水乙醇。

發酵培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，瓊脂12 g/L，接種前加入5%無水乙醇。

1.1.2?? 試劑

無水葡萄糖，山東西亞化學工業有限公司提供;硫酸鎂，天津市北辰方正試劑廠提供;磷酸二氫鉀，北京精求化工廠提供;酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限責任公司提供;無水乙醇，天津歐博凱化工有限公司提供;瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司提供;甲醇（色譜純）、甘油，北京博奧拓達科技有限公司提供。

1.2?? 儀器與設備

高效液相色譜儀，安捷倫科技公司產品;超凈工作臺，蘇凈安泰AIRTECH產品;AD-88型大容量全溫氣浴振蕩器，常州國宇儀器制造有限公司產品;立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品;MS7-H550-Pro型磁力攪拌器，SCILOGEX產品。

1.3?? 方法

1.3.1?? 醋酸菌的篩選

從發酵了12，18，24，30，36 d的醋醅中采樣約10 g，再分別加入裝有50 mL蒸餾水的錐形瓶中，于28 ℃條件下，以轉速180 r/min振蕩培養30 min，將樣品稀釋至10-3，吸取50 μL涂布至基礎培養基，于28 ℃恒溫培養箱中培養，菌落長出后，多次分離純化，直至長出單一菌落，最后挑取菌落加入到甘油培養基中，于-20 ℃的冰箱中保存備用。

1.3.2?? 產酸定性試驗

挑取菌種于發酵培養基活化2次，接入到加有溴甲酚紫酸堿指示劑的基礎培養基，于28 ℃條件下培養2～3 d，可使培養基變成黃色的菌株為產酸細菌。

1.3.3?? 菌種鑒定

篩選出菌種后編號為1，觀察其形態特征并進行分子生物學鑒定，確定其分類地位。

1.3.4?? 醋酸菌的產酸特性試驗

醋酸菌涂布發酵培養基，于恒溫培養箱活化2～ 3 d，挑取已活化的菌株接種到試管發酵培養液，于振蕩培養箱培養1～2 d，吸取2%的發酵培養液至錐形瓶培養48 h，從0 h開始，每隔12 h采一次樣。乙醇體積分數設置6個梯度，分別是0，2%，4%，6%，8%，10%;培養溫度分別為37，42，47 ℃，通過高效液相色譜儀測定產酸類型和產酸量。

1.3.5?? 高效液相色譜條件

產酸高效液相色譜檢測條件參照楊鈺昆等人[16]的測定方法。色譜柱為AQ-C18;流動相為甲醇∶磷酸二氫鉀（0.02 mol/L）為3∶97（V/V），磷酸調pH值至2.7，流速1.00 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

1.3.6?? 數據處理

將通過3次重復試驗得到的數據利用SPSS 20軟件分析和Excel軟件繪制圖表。

2?? 結果與分析

2.1?? 醋酸菌的鑒定

2.1.1?? 醋酸菌的分離

菌落形態見圖1。

該菌長勢良好，菌落為白色小圓形，表面光滑，邊緣整齊。

2.1.2?? 醋酸菌的鑒定

（1）形態學鑒定。挑取醋酸菌滴至有無菌水的載玻片上，干燥后用草酸銨結晶紫染液染色60 s，純凈水沖去多余染液，干燥后進行光學顯微鏡觀察。菌體呈短棒狀，單個或多個排列。

顯微鏡觀察圖見圖2。

（2）分子生物學鑒定。

醋酸菌的系統發育樹見圖3。

2.2?? 37 ℃條件下發酵過程中有機酸的含量變化

2.2.1?? 乳酸含量變化

乳酸含量變化見圖4。

由圖4可知，不同乙醇含量的發酵液中，乳酸均呈增加趨勢。乳酸含量受乙醇體積分數影響較大，發酵48 h后，乙醇體積分數為8%和10%的培養液中乳酸含量最低，為2.6 mg/mL;添加量為2%時，乳酸含量達到最大，為4.7 mg/mL。

2.2.2?? 乙酸含量變化

乙酸含量變化見圖5。

由圖5可知，乙醇體積分數為2%時乙酸含量由0增加到1.8 mg/100 mL;添加8%和10%乙醇時，發酵0 h檢測到乙酸含量為0.34 mg/100 mL和-0.36 mg/100 mL，可能是種子培養基代入，12 h后下降到0;添加0，4%，6%乙醇在發酵過程中沒有檢測到乙酸。

2.2.3?? 檸檬酸含量的變化

檸檬酸含量變化見圖6。

由圖6可知，乙醇含量為4%時檸檬酸含量最高，發酵24 h含量最大，為0.08 mg/mL，高于添加量為8%的檸檬酸含量。不同的乙醇添加量對發酵過程中檸檬酸含量的影響各不相同，其中添加量為10%時檸檬酸含量最低，可見高濃度乙醇含量不利于醋酸菌的發酵。

2.3?? 42 ℃條件下發酵過程中有機酸的含量變化

2.3.1?? 乳酸含量變化

乳酸含量變化見圖7。

由圖7可知，乙醇添加量越少，發酵過程中乳酸含量增加越多，發酵48 h添加6%乙醇的培養液中，乳酸含量最高達到3.9 mg/mL;添加量為10%的乙醇在發酵至48 h時，乳酸含量最低，為3.1 mg/mL。

2.3.2?? 乙酸含量變化

乙酸含量變化見圖8。

由圖8可知，乙醇添加量為8%時，在48 h檢測到乙酸含量為3.4 mg/100 mL，高于37 ℃乙酸的最高含量;添加10%乙醇，發酵液中乙酸含量維持在2.5～3.4 mg/100 mL，高于添加6%乙醇檢測到的乙酸含量;添加0，2%，4%乙醇在發酵過程中沒有檢測到乙酸。

2.3.3?? 檸檬酸含量變化

檸檬酸含量變化見圖9。

由圖9可知，乙醇添加量越少，對發酵過程中檸檬酸含量的影響越低，發酵過程中檸檬酸均呈增加的趨勢，添加量為4%的發酵液中檸檬酸含量最多，48 h達到0.17 mg/mL。

2.4?? 47 ℃條件下發酵過程中有機酸的含量變化

2.4.1?? 草酸含量變化

草酸含量變化見圖10。

由圖10可知，不添加乙醇的培養液中草酸含量最高，48 h含量達到2.5 mg/100 mL，在整個發酵過程中，添加2%乙醇的培養液中生成的草酸為1.7 mg/100 mL，均高于其他乙醇添加量;添加10%時草酸含量增加最低，發酵至48 h只有1.03 mg/100 mL。

2.4.2?? 乙酸含量變化

乙酸含量變化見圖11。

由圖11可知，除0外，不同乙醇添加量的發酵液中，乙酸含量都呈增長趨勢，其中添加2%的乙醇時乙酸含量最高，發酵48 h可達1.97 mg/100 mL;不添加乙醇的培養液中乙酸含量為0，可見乙醇可促進乙酸的生成。

2.4.3?? 乳酸含量變化

乳酸含量變化見圖12。

由圖12可知，乳酸含量在發酵24 h內都有不同程度的下降，24～48 h繼續增長，可能是由于發酵初期營養物質消耗太快，乳酸作為碳源被利用。觀察不同乙醇含量對乳酸的影響，得出添加2%的乙醇，乳酸含量最高，發酵48 h達到5.02 mg/mL;添加4%乙醇乳酸含量最低，在48 h檢測只有3.19 mg/mL，低于42 ℃培養條件下檢測到的乳酸含量，可見溫度也是影響發酵的關鍵因素之一。

3?? 結論

試驗從生料醋醅中篩選出醋酸菌，經形態學和16S rDNA鑒定為巴氏醋桿菌，通過改變其發酵過程中的溫度和乙醇添加量，研究其對醋酸菌產酸特性的影響。

溫度設置37，42，47 ℃ 3個梯度，乙醇添加量設置0，2%，4%，6%，8%，10% 6個梯度。將2%的種子培養液接入發酵液后通過高效液相色譜檢測樣品，檢測到的有機酸有草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸，比趙方圓等人[17]的試驗結果多一類草酸。不同溫度、乙醇含量對有機酸的生成影響較大，乙醇添加量為10%時有機酸的生成都受到了抑制，可見高濃度的乙醇會影響微生物的活性，與張月陽等人[18]的研究結果一致。37，42，47 ℃ 3個溫度下最適宜有機酸生成的乙醇添加量分別是4%，6%，2%，耐受性低于孫文瑛等人[19]從腐爛水果中篩出的耐11%乙醇的醋酸菌。分析不同溫度下幾種有機酸的產酸量，可知42 ℃更適宜巴氏醋桿菌產酸，此菌株對溫度的耐受性高于邵建寧等人[20]研究的耐40 ℃高溫的醋酸菌。檢測到的有機酸中，乳酸含量最高為5.0 mg/mL，在42 ℃，8%乙醇條件下乙酸含量最高為4.2 mg/100 mL，二者在醋中均是含量最高的有機酸，與方冠宇等人[21]的研究結果一致。草酸、檸檬酸的含量最高時分別是2.5 mg/100 mL，0.17mg/mL，這類不揮發有機酸的存在很好地中和了乙酸帶來的刺激感，使醋的酸味更加柔和爽口。

通過對生料醋醅中的巴氏醋桿菌進行研究，挑選出發酵的最適溫度和最適乙醇含量，優化生產工藝，最大程度增加生料醋中有機酸的含量，提升生料醋的口感，也為生料醋產品的進一步開發提供參考。

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收稿日期：2019-10-14

基金項目：山西省重點研發計劃項目（201703D211010，201803D221008-9）。

作者簡介：李陽（1994—?? ），女，碩士，研究方向為食品科學與工程。

*通訊作者：張麗珍（1977—?? ），女，教授，博士，研究方向為生物資源的篩選及利用。