顱骨與骨髓源性間充質干細胞移植治療大鼠缺血性腦卒中療效對比觀察

蘇紅軍，相蕾

1天津市寶坻區人民醫院，天津301800；2天津環湖醫院

近年來，中樞神經系統疾病的藥物和手術治療方面取得了較多進展，但尚不能提供根治性治療。間充質干細胞(MSCs)移植作為一種治療中樞神經系統疾病的新方法受到了廣泛關注。有研究報道，在卒中模型中，MSCs移植可修復受損腦組織，促進神經功能恢復[1， 2]。一些研究表明，不同來源的MSCs的特征可能有所不同[3，4]。因此，MSCs移植的效果可能受MSCs來源的影響。在MSCs的來源中，顱骨穹窿和面部的一些骨組織來自顱神經嵴，四肢、髂骨和椎骨的骨組織來自中胚層[5]。Ullah等[6]研究顯示，牙髓源性干細胞來源于顱神經嵴細胞，具有顯著的神經源性活性，這是其他成人體細胞所沒有的?；谶@些發現，我們推測顱骨來源的MSCs(cMSCs)對中樞神經系統疾病(包括缺血性卒中)具有很高的治療潛力。2017年6月～2019年6月，本研究對比觀察了cMSCs與骨髓間充質干細胞(bMSCs)移植治療大鼠缺血性腦卒中的效果?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要實驗材料 雄性SD大鼠100只，4～10周齡，體質量250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(動物使用許可證標號：SCXK滬2016-0005)。生長培養基購自美國Invitrogen公司。TrypLETMSelect購自美國Thermo Fisher Scientific公司?？勾笫驝D45、CD90、CD29、CD44和CD34均購自美國BD Biosciences公司。FACSVerse系統購自美國BD Biosciences公司。成骨誘導分化培養基購自德國Promocell公司。茜素紅染液購自美國Sigma-Aldrich公司。油紅O染色(10 μmol/L)購自美國Sigma-Aldrich公司。Eclipse TE300倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。TRIzolTM試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。RT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。TUNEL溶液購自美國Roche公司。二氨基聯苯胺(DAB)購自北京英特利根生物科技有限公司。

1.2 cMSCs與bMSCs的分離、鑒定 取6只4～5周齡雄性SD大鼠的股骨和脛骨作為骨髓標本，接種在生長培養基上，將黏附于培養皿底部的細胞作為第一代的bMSCs并傳代數次，分離出bMSCs。取6只雄性SD大鼠的顱骨，將骨膜、肌肉、硬腦膜和嗅神經完全取出，將標本接種于生長培養基上，分離出cMSCs。收集第3代的bMSCs和cMSCs，通過流式細胞術檢測MSCs特異性標志物進行鑒定，bMSCs ：CD29、CD90、CD44、CD34、CD45陽性表達率分別為98.7%、99.1%、95.8%、0.3%、0.3%;cMSCs ：CD29、CD90、CD44、CD34、CD45陽性表達率分別為99.2%、96.2%、98.1%、0.3%、0.3%。取80%～90%融合的P3代bMSCs和cMSCs，檢測其成骨分化和成脂分化的能力以鑒定MSCs。結果見圖1。

注：A為bMSCs和cMSCs的原細胞；B為分化后的成骨細胞；C為分化后的脂肪細胞。

圖1 bMSCs和cMSCs向成骨細胞和脂肪細胞的分化潛能

1.3 cMSCs與bMSCs中神經嵴相關基因、神經營養因子檢測 采用qRT-PCR法檢測cMSCs與bMSCs中神經嵴相關基因(Snail、Slug)和神經營養因子(Bdnf、Gdnf、Ngf)的mRNA。

1.4 大腦中動脈閉塞模型(MCAO)建立與分組處理 隨機選擇90只大鼠建立MCAO模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)進行麻醉。取頸部中間切口，并在鎖骨肌和胸腹肌之間找到右頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。將ECA的分叉結扎，同時將ECA與CCA的連接處結扎。動脈夾夾住CCA的近端部分。將3-0尼龍縫合線穿過ECA的近分叉的底部并打結，不完全收緊。在CCA的分叉距離1.0 mm處使用微剪刀儀器切口。將單絲尼龍縫合線輕輕插入ICA中，使其尖端達到大腦中動脈(MCA)起始點，將縫合線收緊以阻斷MCA血液供應。將切口分層縫合，并將末端約1 cm的單絲尼龍縫合線留在外面。在缺血2 h后，小心拉出左單絲直至感覺到阻力，表明尖端已至CCA分叉處?；謴蚆CA血供。在再灌注21 d后處死大鼠并取出大腦，以供制備各種組織切片。另選擇20只大鼠為假手術組，僅手術暴露CCA、ECA和ICA，但不對其進行處理。對建模大鼠進行Bederson評分[7]，評分高于1分判定為建模成功。90只建模大鼠中，排除4只死亡大鼠，排除Bederson評分為0或4分的5只大鼠，在剩余81只大鼠中選擇60只，隨機分為模型組、bMSCs組、cMSCs組各20只。模型組單純給予PBS，bMSCs組和cMSCs組大鼠分別在MCAO后24 h經尾靜脈注射bMSCs、cMSCs(1.0×106/300 μL PBS)。模型組和假手術組在相同時間注射等體積的PBS。

1.5 運動功能評價 術后2、7、14、21 d分別進行平衡木實驗和Garcia評分。每項測試進行3次，結果取均值。平衡木實驗：將大鼠放在一條狹窄的木條(30.0 cm×1.3 cm)上平衡進行測定；四肢均在木條上平衡計1分，單側肢體能抓住木或在木頭上搖晃計2分，一條或兩條肢體從木上滑落計3分，三條肢體從木上滑落計4分，在木上掙扎后摔倒計5分，懸掛在木頭上掙扎后摔倒計6分，完全不掙扎立即摔倒計7分。Garcia評分包括評估自發活動、四肢對稱運動、前爪伸直、攀爬、身體本體感覺和對觸碰振動的反應。

1.6 海馬組織病理觀察 再灌注21 d后處死大鼠并取出大腦，將制成的海馬組織石蠟切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中浸泡10 min。然后將切片依次用100%、95%、90%、75%乙醇洗滌5 min，蘇木精染色10 min，再用1%蘇紅染色5 min，用中性樹脂固定。在BZ-9000多功能顯微鏡下觀察海馬組織病理變化。

1.7 海馬組織局灶性腦梗死(CI)面積測算 再灌注21 d后處死大鼠并取出大腦，將制備好的海馬組織作2.0 mm厚冠狀切片浸泡在TTC溶液中，37 ℃恒溫黑暗中孵育，直到正常區域被染成亮紅色、梗死區域被染成白色。將染色切片放入4%甲醛溶液固定24 h，取出腦切片，濾紙脫水。每組5個切片，隨機抽取3個切片，用Image J軟件分析并計算CI面積(梗死區面積占大腦總面積的百分比)。

1.8 海馬組織神經元凋亡率測算 再灌注21 d后處死大鼠并取出大腦，取各組大鼠海馬組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，做3 μm厚切片，室溫孵育15 min，PBS洗滌后，加入50 μL的TUNEL溶液，37 ℃培養60 min，然后加入50 μL轉化劑過氧化物酶37 ℃中孵育30 min，再加入50 μL的DAB室溫孵育10 min。蘇木精再次用于細胞核染色，并在光學顯微鏡下對封閉切片進行圖像分析。被染色呈黃色或棕色的細胞為TUNEL陽性細胞。每個切片選取6個不同的高倍視野進行觀察，記錄每個高倍視野下的 TUNEL陽性細胞數和細胞總數。根據公式計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=TUNEL陽性細胞/總細胞數×100%。

2 結果

2.1 cMSCs與bMSCs中神經嵴相關基因、神經營養因子表達比較 cMSCs中Snail、Slug、Bdnf、Gdnf、Ngf mRNA相對表達量均高于bMSCs(P均<0.05)。見表1。

表1 bMSCs和cMSCs中Snail、Slug、Bdnf、Gdnf、Ngf mRNA表達比較

注：與bMSCs相比，*P<0.05。

2.2 各組大鼠運動功能評分比較 假手術組均未發現明顯的神經功能障礙，其他三組大鼠均表現出不同程度的神經功能障礙。隨著時間的推移，各組從平衡木實驗得分逐漸下降，Garcia評分逐漸升高。模型組、bMSCs組、cMSCs組在各時點平衡木實驗得分高于假手術組，Garcia評分低于假手術組(P均<0.05)。bMSCs組、cMSCs組建模后7、14、21 d的平衡木實驗得分低于模型組，Garcia評分高于模型組(P均<0.05)；cMSCs組建模后7、14、21 d平衡木實驗得分低于bMSCs組，Garcia評分高于bMSCs組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 大鼠運動功能評分比較(分，

注：與同時點假手術組相比，*P<0.05；與同時點模型組相比，#P<0.05；與同時點bMSCs組相比，△P<0.05。

2.3 各組大鼠海馬組織病理變化 假手術組海馬組織結構完整且均勻排列，具有清晰的核仁，皮質錐體細胞的核大而圓，且細胞膜清晰，細胞數量相對較大。模型組腦組織結構消失，神經元損傷加重，細胞體積減小，細胞變圓形或卵形，核固縮，間質水腫加重，細胞間隙擴大。在bMSCs組中，海馬組織結構不清晰、混亂，錐體細胞松散排列，體積減小，細胞間隙擴大，核固縮，部分細胞壞死。與bMSCs組相比，cMSCs組的損傷相對減輕，壞死區域縮小，細胞結構不完整，核固縮程度下降，間質水腫減輕(見圖2)。

注：A為假手術組；B為模型組；C為bMSCs組；D為cMSCs組。

圖2 各組大鼠海馬組織病理變化

2.4 各組大鼠海馬組織CI面積比較 在TTC染色后，假手術組大鼠腦切片顯示為紅色，沒有CI區。模型組大鼠右側大腦皮層和海馬區與正常組比較，呈現白色CI病變。假手術組、模型組、bMSCs組、cMSCs組CI面積分別為0、28.94%±2.07%、20.54%±1.13%、15.17%±1.04%。bMSCs組、cMSCs組CI面積小于模型組，cMSCs組CI面積小于bMSCs組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬組織CI面積(TTC染色)

2.5 各組大鼠海馬組織神經元凋亡率比較 假手術組、模型組、bMSCs組、cMSCs組海馬組織神經元凋亡率分別為6.02%±0.89%、74.30%±4.82%、56.21%±4.06%、33.99%±3.84%。模型組、bMSCs組、cMSCs組海馬組織中神經元凋亡率高于假手術組，bMSCs組、cMSCs組神經元凋亡率低于模型組，cMSCs組神經元凋亡率低于bMSCs組(P均<0.05)。見圖4。

注：A為假手術組；B為模型組；C為bMSCs組；D為cMSCs組。

圖4 TUNEL法檢測各組大鼠海馬神經元細胞凋亡情況

3 討論

顱骨主要來源于顱神經嵴，是通過膜內而不是軟骨內骨化發育形成的扁平骨。盡管顱骨具有一個狹小的骨髓空間，但Zhao等[8]研究顯示顱骨縫合線為MSCs提供了一個生存環境。而四肢、髂骨和椎骨的骨骼來自中胚層[5]，長骨或髂骨的骨髓中存在MSCs。以往的研究表明，MSCs在體外表現出神經分化的潛力[9，10]。而目前普遍認為MSCs移植對體內缺血性腦損傷的治療作用與其分泌的一系列營養因子有關，進而促進了缺血性腦組織修復[11]。神經營養因子發揮多種神經保護作用，包括刺激組織內的干細胞增殖和分化[12]。Bdnf是一種重要的神經營養因子，可促進神經發育和血管生成，提供神經保護，減輕炎癥和細胞凋亡，改善缺血性腦損傷后的突觸可塑性[13]。Matsuda等[14]報道，Bdnf有助于預防IL-1β和TNF-α誘導的內皮屏障功能障礙和調節炎癥反應。曹景麗等[15]研究表明，Bdnf通過增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和抑制細胞內鈣超載來減少心肌細胞凋亡。Ngf也是一種神經營養因子，體外研究已證實其神經保護作用[16]。Bianco等[17]報道Ngf能夠快速激活抗氧化防御系統，抑制活性氧(ROS)的生成。本研究成功分離和鑒定了cMSCs和bMSCs，并通過檢測顯示cMSCs組比bMSCs組表達更多的神經嵴相關基因Snail、Slug和神經營養因子Bdnf、Gdnf、Ngf。這些結果提示cMSCs來源于神經嵴，而不是中胚層； cMSCs大量表達神經營養因子Bdnf和Ngf，cMSCs的發育特異性可能使得神經營養因子大量表達。

缺血性腦卒中的神經細胞凋亡與許多事件有關。細胞凋亡最初是由鈣內流、線粒體受損和能量消耗引起的，隨后是由于氧和葡萄糖消耗引起谷氨酸興奮性毒性[18]。NO、氧自由基和其他ROS的釋放會進一步損傷神經元。此外，內皮細胞釋放MMP和其他蛋白酶破壞血腦屏障，導致免疫細胞浸潤，而免疫細胞釋放的細胞因子也會增強炎癥反應，加重腦損傷[19]。至于運動缺陷的恢復，有研究報告，初始運動缺陷水平和隨后的恢復依賴于皮質纖維投射纖維的完整性[20]。本研究發現，與模型組相比，bMSCs和cMSCs移植治療有效改善了MCAO大鼠的神經功能障礙，并且cMSCs組改善效果優于bMSCs組。因此，cMSCs移植較bMSCs可以誘導MCAO大鼠神經功能更好的恢復。此外，與bMSCs組相比，cMSCs組大鼠海馬組織CI面積和海馬神經元凋亡率均顯著降低，從而解釋了cMSCs組大鼠運動功能改善程度優于bMSCs組，進一步說明減少細胞凋亡可能是bMSCs、cMSCs移植治療缺血性腦卒中的一個機制。

鑒于cMSCs可分泌豐富的神經營養因子，cMSCs移植可促進缺血性腦卒中模型大鼠神經功能恢復且效果優于bMSCs移植，因此，顱骨可能是用于治療中樞神經系統疾病的理想MSCs來源。下一步還應考慮使用源自人顱骨的MSCs進行移植治療研究。