精液冷凍前優化處理方式對精子冷凍復蘇效果的影響

梅鳳琦 甄錦壯 麥福勁 何正枝

【摘要】 目的：探討精液冷凍前優化處理方式對不同精子活力的精子冷凍復蘇效果的影響。方法：選取符合條件的標本50份，每份標本等分4份，以原液作為對照（A組），分別采用三種不同方式[洗滌法（B組）、上游法（C組）和密度梯度離心法（D組）]進行處理，再行精子冷凍復蘇。比較不同精子活力標本在不同優化方法處理后的精子冷凍復蘇率。結果：精子冷凍復蘇率由高至低排序為A組>C組>D組>B組。B組和D組精子冷凍復蘇率均顯著低于A組（P<0.05），C組與A組比較差異無統計學意義（P>0.05）。低活力（前向運動精子PR≤32%）標本中，各處理方式精子冷凍復蘇率比較差異無統計學意義（P>0.05）。正?；盍Γㄇ跋蜻\動精子PR>32%）標本中，B組精子冷凍復蘇率顯著低于其余三組（P<0.05），A組、C組、D組三組比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論：精液冷凍前優化處理方式對精子冷凍復蘇率有影響，實際工作中，應根據精液的質量選擇合適的精液冷凍前優化處理方式。

【關鍵詞】 精液冷凍 精液優化處理 精子冷凍復蘇率

Effect of Spermatozoa Selection before Freezing on Recovery Rate of Human Frozen Spermatozoa/MEI Fengqi， ZHEN Jinzhuang， MAI Fujin， HE Zhengzhi. //Medical Innovation of China， 2020， 17（04）： -116

[Abstract] Objective： To investigate the effect of spermatozoa selection before freezing on the recovery rate of human frozen spermatozoa of different sperm motility. Method： A total of 50 specimens that meet the requirements were selected. Each sample was divided into 4 equal parts， and the stock solution was used as a control （group A）. Before sperm freezing and recovery， the spermatozoa selection was carried out in three different ways [washing （group B）， swimming-up （group C） and density-gradient centrifugation（group D）]. The recovery rate of frozen spermatozoa of different sperm motility with different treatment was compared. Result： The sperm recovery rate was ranked from high to low in group A > group C > group D > group B. The sperm recovery rate of group B and group D were significantly lower than those of group A （P<0.05）， and there was no significant difference between group C and group A （P>0.05）. In low vitality （PR≤32%）， there was no significant difference in the sperm recovery rates between the treatments （P>0.05）. In normal vitality （PR>32%）， the sperm recovery rate in group B was significantly lower than those of the other three groups （P<0.05）， and there was no significant difference among group A， group C， and group D （P>0.05）. Conclusion： The spermatozoa selection before freezing has an effect on the recovery rate of frozen spermatozoa.In actual work， the appropriate semen pre-freezing treatment should be selected according to the quality of semen.

[Key words] Frozen spermatozoa Spermatozoa selection Recovery rate of frozen spermatozoa

First-authors address： Shunde Women and Childrens Hospital of Guangdong Medical University （Maternal & Child Health Hospital of Shunde Foshan）， Foshan 528300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.04.028

自精保存作為人類輔助生殖技術（ART）中一個重要組成部分，為男性患者進行ART前提供了精子解決方案[1]。常規精子冷凍保存技術是采用精液原液，但國內生殖中心的冷凍保存空間日漸緊張[2]，繼續使用精液原液作為自精保存將占用更多的空間。精液經過優化處理后，可去除大部分非精子物質，收集活力與形態更好的精子[3]，同時減少了體積，可節省冷凍空間。本文主要探討精液冷凍前優化處理方式對精子冷凍復蘇的影響，特別是對不同活力精子的影響，旨為精液冷凍前選擇合適的優化處理方式提供參考?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月-2019年7月在本院生殖中心就診，進入ART技術治療的男性患者精液標本。所有患者均進行以下檢查：精液常規，乙肝、丙肝、獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）病毒、梅毒螺旋體等感染項目檢查。根據WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》5版標準進行精液分析[4]，將液化正常，精液量≥2.0 mL，精子濃度為（70～200）×106/mL，正常形態≥4%的標本共50份納入研究。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 丹麥ORIGIO SAGE Quinns試劑，ART-1006為精子洗滌培養液，ART-2024為梯度離心培養液，ART-8022為精子冷凍保護試劑。

1.2.2 儀器 生物顯微鏡（奧林巴斯），普通離心機（北京白洋），Makler精子計數板（以色列），培養箱（美國Thermo）。

1.3 方法

1.3.1 精液標本收集 所有研究對象均禁欲2～7 d，在專用取精室內以手淫方式取精，并全部收集于無菌取精杯內，取出的精液標本放置于37 ℃水浴箱內液化。

1.3.2 精液常規分析 精液標本完全液化后，按WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》5版標準進行精液分析，包括精液量、精子濃度、精子活力、正常形態精子百分比等。各處理組冷凍前和復蘇后按同樣方法進行分析。其中前向運動精子（PR）≤32%為低活力，PR>32%為正?；盍?。

1.3.3 精子優化處理方法 每份精液標本充分混勻后，分別取0.5 mL，以原液作為對照，另外用三種不同方法（洗滌法、上游法、密度梯度離心法）進行冷凍前優化處理，共四組。

1.3.3.1 原液（A組） 標本不經處理直接進入冷凍步驟。

1.3.3.2 洗滌法（B組） 標本加入ART-1006混勻后，300 g離心6 min，離心后棄上清，用ART-1006重懸沉淀物，調至0.5 mL后計數備用。

1.3.3.3 上游法（C組） 在標本上方，緩慢加入1.2倍的ART-1006，傾斜45°并置于37 ℃培養箱內上游30 min。上游后吸取上層液，加入ART-1006混勻后，300 g離心6 min，離心后棄上清，用ART-1006重懸沉淀物，調至0.5 mL后計數備用。

1.3.3.4 密度梯度離心法（D組） 在無菌錐形離心管中，用ART-2024制備密度梯度液，下層為80%PureCeption，上層為40%PureCeption。使用

1︰1︰1的體積比，將標本加于梯度液上層。500 g離心15 min，離心后棄上清，保留沉淀物，加入ART-1006試劑后，300 g離心6 min，離心后棄上清，用ART-1006重懸沉淀物，調至0.5 mL后計數備用。

1.3.4 精子冷凍與復蘇

1.3.4.1 精子冷凍 用ART-8022按1︰1體積比例添加到各組精子懸液中。將混合物置于4 ℃冰箱15 min，再懸掛于液氮上方10 cm處15 min，最后投入液氮中保存。

1.3.4.2 精子復蘇 冷凍一周后，將精子混合物從液氮中取出，立即置于37 ℃水浴箱里10 min。充分混勻后進行精液分析。

1.3.5 精子冷凍復蘇效果的評價標準 采用精子冷凍復蘇率作為精子冷凍復蘇效果的評價標準，公式如下：精子冷凍復蘇率=（復蘇后PR百分率）/（冷凍前PR百分率）×100%。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間均數比較采用Friedman檢驗，兩兩比較采用Wilcoxon符號秩檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同冷凍前優化處理方法的復蘇后PR百分率比較 50份標本低活力21份，正?；盍?9份。不同活力的標本，經C組處理，其冷凍復蘇后的PR百分率顯著高于A組、B組、D組（P<0.05），見表1。

2.2 不同冷凍前精液優化方法處理后的精子冷凍復蘇率比較

2.2.1 50份經各精液優化方法處理后的精子冷凍復蘇率比較 各精液優化方法處理后的精子冷凍復蘇率由高至低的排序為A組[（64.36±21.51）%]>C組[（61.93±15.09）%]>D組[（55.37±14.63）%]>B組[（50.93±17.74）%]。C組比A稍低，但差異無統計學意義（P>0.05）;C組與B組和D組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。B組與A組、C組和D組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。D組與A組、B組和C組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.2.2 21份低活動力標本經各種精液優化方法處理后的精子冷凍復蘇率比較 各精液優化方法處理后的精子冷凍復蘇率由高至低的排序為C組[（63.54±15.74）%]>A組[（62.68±22.07）%]>B組[（54.03±18.73）%]>D組[（52.98±13.93）%]，各組精子冷凍復蘇率比較，差異無統計學意義（P=0.119）。

2.2.3 29份正?；盍吮窘浉鞣N精液優化方法處理后的精子冷凍復蘇率比較 各精液優化方法處理后的精子冷凍復蘇率由高至低的排序為A組[（65.58±21.40）%]>C組[（60.76±14.78）%]>D組[（57.10±15.12）%]>B組[（48.68±16.97）%]。B組顯著低于A組與C組，差異有統計學意義（P<0.05）;B組與D組比較，差異無統計學意義（P>0.05）;A組、C組、D組三種優化處理方法精子冷凍復蘇率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

精子在冷凍復蘇過程會有一定的損傷，其機制在于細胞內形成冰晶[5]、產生活性氧（ROS）等[6]，導致復蘇后精子活力下降[7]。有研究提示，精子參數對ART技術結局有一定影響[8-10]。所以提高復蘇后精子活力與冷凍復蘇率成為關鍵。

本研究結果顯示，洗滌組的精子冷凍復蘇率較低。洗滌法采用離心方式去除精漿。離心作為ATR技術中精液處理的常規操作，但離心過程會增加ROS，史瀟等[11]進一步證實離心時間對精子活力有影響。精漿內包含部分抗氧化物質[12]，去除精漿可能讓精子抗ROS能力減弱，導致精子冷凍復蘇率下降。除非精液標本精子濃度很低，則不建議采用洗滌法作為冷凍前優化處理的首選方法。

近年來，很多學者均嘗試在精子冷凍前添加各種物質，如維生素E[13]、番茄紅素[14]、異檸檬酸[15]等，用來提高復蘇后精子活力。雖然這些方法能有效提高精子復蘇后的活力，但目前尚無充分證據證明，冷凍前添加其他物質，對ART技術中后續的胚胎發育是否有影響[16]。所以在實際工作中，添加其他保護劑來提高復蘇后精子活力的應用相對有限。本研究結果顯示，上游法處理后的標本在復蘇后精子活力最高，同時上游組的精子冷凍復蘇率與原液組的相近，特別是低活力（PR≤32%）時，上游法的精子冷凍復蘇率比原液組的稍高。這與Petyim等[17]研究結果相似。上游法在各精子優化處理方法中，對精液標本的干預較少，能篩選出活力較好的精子，并大幅降低死精子的比例。提示自精保存中，特別是低活力標本，采用上游法進行冷凍前優化處理，可提高復蘇后的精子活力，并與精液原液冷凍復蘇有相近的效果。但上游法也有不足，其所收集的精子總數相比其他方法的欠理想[18]。由于ART技術中，如宮腔內人工授精（IUI）和體外受精（IVF）技術，對精子總數有一定要求[19-20]，所以對于低活力且低濃度的標本不建議采用上游法進行冷凍前預處理，否則會造成復蘇后的活動精子總數不足以進行IUI/IVF技術。

密度梯度離心法能收集形態正常和活力較好的精子。鄭春毅等[21]認為，密度梯度離心法更適用于嚴重少、弱、畸形精子癥或精子DNA碎片率較高的標本。本研究中，正?；盍Φ臉吮臼褂蒙嫌畏ɑ蛎芏忍荻入x心法，其精子冷凍復蘇率與原液比較，差異無統計學意義。提示活力正常、低濃度標本可通過密度梯度離心法收集更多的活動精子，并與原液冷凍復蘇有相近的效果。

綜上，精子冷凍前的優化處理方式對精子冷凍復蘇效果有一定影響。為取得與精液原液相近的精子冷凍復蘇效果，同時減少占用冷凍保存空間，可選擇上游法進行冷凍前的精液處理。對于低活力且低濃度的精液標本，則不建議采用上游法。對于活動力正常、低濃度精液標本，還可使用密度梯度離心法收集更多的活動精子。實際工作中，應根據精液質量來選擇合適的方法進行冷凍前預處理。

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（收稿日期：2019-11-11） （本文編輯：程旭然）