桑白皮水煎液及各性味拆分組分對典型熱證模型物質能量代謝的影響?

楊翠蘭，克迎迎，李亞格，袁培培，傅 陽，馮衛生，鄭曉珂Δ

(1. 河南中醫藥大學， 鄭州 450046； 2. 呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心，鄭州 450046)

中藥四性是指寒、熱、溫、涼4種藥性，它反映了藥物影響人體陰陽盛衰、寒熱變化方面的作用傾向[1-2]。本項目首席科學家匡海學教授提出，藥性(氣)是藥物通過不同途徑，以主要影響機體的能量代謝、物質代謝為特征的，與治療作用有關或無關的，但均可影響藥物療效發揮或與副作用發生有關的一類生物學效應。其中能促進機體能量代謝、物質代謝的中藥多具有熱(或溫)性，抑制機體能量代謝、物質代謝的中藥多具有寒(或涼)性。中藥藥性(氣)可以通過宏觀的正?；蚝疅釀游锬Ｐ蛯嶒?，以及系統生物學等方法予以評價歸屬[3-4]。在這一假說的指導下，本實驗基于熱證模型歸屬桑白皮性味拆分組分的寒熱藥性。

桑白皮為?？浦参锷orusCortexL.的干燥根皮[5],前期研究將桑白皮拆分為成分互不交叉的黃酮、苯駢呋喃、二苯乙烯、多糖、脂肪油組分[6-7]。為驗證《黃帝內經》中用藥原則“熱者寒之”的科學性及桑白皮性味拆分組分的寒涼藥性，本實驗采用優甲樂建立熱證模型[8]，給藥15 d后檢查各組大鼠體質量、肛溫、自主活動次數及物質能量代謝相關酶的表達，以期更好地闡釋桑白皮各性味拆分組分的藥性。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性SPF級SD大鼠80只，體質量(180～200)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(許可證SCXK(京)2012-0001)。

1.2 藥物

優甲樂(左甲狀腺素鈉片，MerkSerono，生產批號210128)。桑白皮性味拆分組分制備：桑白皮水煎液濃縮后，上DiaionHP-20柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇洗脫，水洗脫液經過醇沉、干燥得到多糖組分，提取率4.4%。其他3個洗脫液經濃縮、干燥分別得到黃酮、苯駢呋喃和二苯乙烯組分，提取率分別為5.8%、0.31%、0.25%。脂肪油組分的提取方法：精密稱取10 g干燥至恒重的桑白皮藥材粉末(過60目篩)于濾紙筒內，置索氏提取器中，加入100 ml石油醚(60～90 ℃)回流提取6 h，提取液放冷至室溫過濾，回收濾液，低溫揮去溶劑，100 ℃干燥1 h后冷卻，精密稱定，經計算桑白皮得油率3.10%。

1.3 試劑與儀器

GCK(glucokinase葡萄糖激酶)、PFK-1(phosphofructokinase-1果糖磷酸激酶)、PGK(phosphoglycerate kinase磷酸甘油酸激酶)、PK(pyruvate kinase丙酮酸激酶)、PDH(pyruvate dehydrogenase丙酮酸脫氫酶)、acetyl-CoA(acetyl coenzyme A乙酰輔酶A)、CS(citrate synthase檸檬酸合酶)、ICD(isocitrate dehydrogenase異檸檬酸脫氫酶)、α-KGDHC(α-ketoglutarate dehydrogenaseα-酮戊二酸脫氫酶)、FUM(fumarase延胡索酸酶)、PYGL(glycogen phosphorylase糖原磷酸化酶)、GSK-3(glycogen synthase kinase糖原合成酶激酶-3)、ATGL(adipose triglyceride lipase脂肪甘油三酯脂酶)及能量代謝相關酶CCR(cytochrome C reductase細胞色素C還原酶)、COX(cytochrome C oxidase細胞色素C氧化酶)、ATPs(ATP synthaseATP合酶)、ADK(adenylate kinase腺苷酸激酶)、Na+-K+ATP酶、ATP、ADP、NAD+、NADH、NAD+/NADH含量檢測試劑盒(蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號20141203 A)，其他各種化學試劑均為市售分析純(天津市恒興化學試劑制造有限公司)。

YLS-IB多功能大鼠自主活動記錄儀(濟南益延科技發展有限公司)；醫用電子體溫計(東阿阿膠阿華醫療器械有限公司)；Multiskan MK3酶標儀(Thermo，USA)；5810R高速冷凍離心機(Eppendorf，Germany)；SK-1快速混勻器(常州國宇儀器制造有限公司)；移液器(Gilson，France)；BT25S十萬分之一精密分析天平(Sartorius，Germany)；DZF-6050B真空干燥箱(北京恒泰豐科試驗設備有限公司)；BCD-206TAS低溫冰箱(海爾公司)；常規手術器械。

2 方法

2.1 動物的分組及給藥

動物適應性喂養1周后，隨機分為NC組(Normal Control group正常對照組)、M組(Model group熱證模型組)、桑白皮水煎液組(MC)、黃酮組分組(Fla)、苯駢呋喃組分組(Ben)、二苯乙烯組分組(Oli)、多糖組分組(Pol)、脂肪油組分組(FO)。熱證模型每日上午9點灌胃優甲樂120 μg/kg，NC組灌胃生理鹽水，每日下午灌胃目的中藥，NC組、M組給予生理鹽水，MC組給予2.8 g/kg桑白皮水煎液，Fla組給予0.1624 g/kg黃酮組分，Ben組給予0.00868 g/kg苯駢呋喃組分，Oli組給予0.007 g/kg二苯乙烯組分，Pol組給予0.1232 g/kg多糖組分，FO給予0.0868 g/kg脂肪油組分，連續給藥15 d。15 d后取大鼠肝臟、心臟迅速凍存于液氮中后，轉移至-80 ℃冰箱保存備用。

2.2 給藥期間各組大鼠體質量、肛溫、自主活動次數的記錄

記錄給藥前及給藥期間各組大鼠體質量及肛溫的變化，同時記錄給藥第15天各組大鼠5 min內的自主活動次數。

2.3 物質能量代謝相關指標的檢測

ELISA法檢測各組大鼠肝臟中GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、GSK-3、ATGL、CCR、COX、ATPs、ADK、ATP、ADP、NAD+、NADH、NAD+/NADH的水平以及各組大鼠心臟中Na+-K+ATP酶的水平。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 桑白皮性味拆分組分對熱證大鼠體質量、肛溫、自主活動的影響

表1示，與NC組比較，M組大鼠體質量極顯著降低(P<0.01)，桑白皮水煎液及各性味拆分組分組大鼠體質量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與NC組比較，M組大鼠肛溫、自主活動極顯著升高(P<0.01)，與M組比較，桑白皮水煎液及各性味拆分組分組大鼠肛溫、自主活動極顯著降低(P<0.01)。

3.2 桑白皮性味拆分組分對熱證大鼠物質代謝相關指標的影響

表2、3示，與NC組比較，M組GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、GSK-3、ATGL的表達顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與M組比較，桑白皮水煎液及各性味拆分組分組GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、GSK-3、ATGL的表達顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表1 桑白皮性味拆分組分對熱證大鼠體質量、肛溫、自主活動的影響

注：與NC組比較：**P<0.01；與M組比較：#P<0.05，##P<0.01

3.3 桑白皮性味拆分組分對熱證大鼠能量代謝相關指標的影響

表4、5示，與NC相比，M組CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶、ATP、NADH的表達顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，ADP、NAD+、NAD+/NADH的表達顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與M組比較，桑白皮各給藥組CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶的表達顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)，ADP、NAD+、NAD+/NADH的表達顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

表2 桑白皮水煎液及各性味拆分組分對熱證大鼠營養物質氧化成乙酰輔酶A階段相關酶的影響

注：與NC組比較：*P<0.05，**P<0.01；與M組比較：#P<0.05，##P<0.01

表3 桑白皮性味拆分組分對熱證大鼠三羧酸循環階段相關酶的影響

注：與NC組比較:*P<0.05，**P<0.01；與M組比較:#P<0.05，##P<0.01

表4 桑白皮性味拆分組分對熱證大鼠能量代謝相關酶的影響

注：與NC組比較：**P<0.01；與M組比較:#P<0.05，##P<0.01

表5 桑白皮性味拆分組分對熱證大鼠能量代謝相關物質含量的影響

注：與NC組比較：**P<0.01；與M組比較:#P<0.05，##P<0.01

4 討論

中醫診斷的寒熱之證與機體的物質能量代謝密不可分，而中藥的寒熱藥性可能會通過影響機體物質能量代謝的某些環節，來調節機體的寒熱之證。吳桂琴、徐珊等[9-11]發現，寒性藥龍膽草、黃芩、生黃柏能不同程度地抑制熱證大鼠能量代謝。能量代謝非常復雜，包括氧化磷酸化過程中的許多酶和因子，而這些酶和因子起著調控作用[12]。本實驗從物質能量代謝的角度出發，探討桑白皮性味拆分組分對熱證模型物質能量代謝的影響，以此歸屬桑白皮各性味拆分組分的寒熱藥性。

首先分析基礎體征指標，與正常組比較，熱證模型組大鼠的體質量顯著降低，肛溫及自主活動顯著升高，這符合臨床熱證的病理表現。與模型組比較，桑白皮各性味拆分組分組大鼠體質量增加，肛溫降低，自主活動減少，說明大鼠熱證病證有所改善，推測桑白皮各性味拆分組分的藥性可能為寒涼。

在生理狀態下，體內物質能量代謝處于動態平衡，研究表明機體所需要的能量主要是通過生物氧化提供。根據三大營養物質氧化分解、釋放能量的特點，可將生物氧化分為三個階段：第一階段，三大營養物質經過各自的代謝途徑生成乙酰輔酶A。這個階段包括葡萄糖有氧氧化及丙酮酸氧化脫羧生成acetyl-CoA過程，這個過程中GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH等酶發揮著重要作用。實驗結果顯示，熱證模型大鼠肝臟中GCK、PFK-1、PK、PGK、PDH、acetyl-CoA的表達顯著增加，而給藥桑白皮性味拆分組分后均能夠降低其酶的表達，與桑白皮水煎液的結果類似，說明桑白皮各性味拆分組分能夠抑制熱證模型大鼠體內的物質代謝。這可能與桑白皮各性味拆分組分的寒涼藥性有關。

第二階段，acetyl-CoA進入三羧酸循環，脫羧生成CO2，脫氫生成NADH+H+和FADH2，此階段中有CS、ICD、α-KGDHC及FUM酶的參與，在模型組大鼠體內CS、ICD、α-KGDHC及FUM的水平均增加，而給藥桑白皮性味拆分組分后均能夠下調其酶的表達，與桑白皮水煎液類似，這說明桑白皮各性味拆分組分能夠改善三羧酸循環過程的快速代謝狀況。第三階段，NADH+H+或FADH2攜帶的2H通過線粒體內膜上的呼吸鏈依次傳遞，最終與氧結合生成水，并釋放大量的能量。在此階段中，CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶為關鍵限速酶。結果顯示，熱證模型組大鼠CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶的表達增加，而給藥桑白皮性味拆分組分后各酶的表達均下降，與桑白皮水煎液效果相似，進一步說明桑白皮各性味拆分組分的藥性可能為寒涼。

機體在應激狀態下，還可以通過肝糖原的分解以及脂肪動員提供能量，在這個過程中PYGL和GSK-3在糖原的分解和合成中發揮著重要作用。PYGL是催化糖原分解生成葡萄糖的關鍵別構酶，GSK-3可以間接抑制糖原的合成，ATGL在脂肪動員中發揮著重要作用。分析實驗結果，與熱證模型組比較，熱證模型大鼠體內PYGL、GSK-3和ATGL的水平均升高，而給藥桑白皮性味拆分組分后PYGL、GSK-3和ATGL的水平均降低，與桑白皮水煎液作用一致，說明桑白皮各性味拆分組分能夠抑制糖原分解及脂肪動員進程，這與其藥性為“寒涼”有關。

從物質代謝和能量代謝的角度分析，熱證模型組大鼠的肛溫、自主活動次數、物質能量代謝相關酶GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、ATGL、ATP、CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶、NAD+、NAD+/NADH的表達及含量極顯著升高，ADP、NADH的表達極顯著降低，表明熱證模型大鼠的物質能量代謝處于高水平亢奮狀態，而給藥桑白皮各性味拆分組分后能夠顯著抑制熱證模型物質能量代謝的高水平亢奮狀態，與桑白皮水煎液效果類似。這與本課題“促進機體能量、物質代謝的中藥具有熱(或溫)性，抑制機體能量、物質代謝的中藥具有寒(或涼)性”這一假說相符。同時也與中醫臨床“熱者寒之”的治則吻合，因此說明桑白皮各性味拆分組分的藥性為寒(涼)性。