桑白皮炒制前后HPLC 指紋圖譜比較研究*

趙子楠，閆立文，趙 凱，3△

1 北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2 河北凱盛醫藥科技有限公司；3 江西歐氏藥業有限責任公司

桑白皮又名桑根白皮、白桑皮，為?？浦参锷orus albaL. 的干燥根皮。始載于《神農本草經》，列為中品。桑白皮性寒味甘，歸肺經，具瀉肺平喘、利水消腫功效，主治肺熱喘咳，水腫，尿少等證［1-2］?，F代研究表明，桑白皮的化學成分豐富，主要含有黃酮類、酚酸類、生物堿類等化合物［3］?，F代藥理學研究表明桑白皮及其活性成分具有抗癌、抗病毒、降血糖、鎮痛抗炎、祛痰等多種藥理活性［4］。

國家中醫藥管理局在2018 年4 月公布了《古代經典名方目錄（第一批）》（以下簡稱《目錄》），瀉白散為《目錄》中第40 個處方，處方組成中以桑白皮為君藥，其炮制程度被描述為“細銼炒黃”。炒桑白皮為遵古炮制，與我國現行《中華人民共和國藥典》（一部）中收載的飲片類型桑白皮和蜜桑白皮不同。炒桑白皮的炮制方式最早出現在宋代《博濟方》，曰“剉炒”，后被歷代沿用。對于其炮制程度，明代《證治準繩》、清代《小兒藥證直訣》聚珍本及現行《 中藥炮制經驗集成》中均提到為“炒黃”［5-7］。

炮制工藝不同往往帶來藥效以及化學成分的差異［8-10］。桑白皮化學成分豐富，很難用一種或幾種化學成分反映其藥材質量，指紋圖譜是國內外廣泛認可的一種中藥質量評價模式。桑白皮的HPLC 指紋圖譜多集中于成方制劑以及蜜炙前后的指紋圖譜研究，有關炒桑白皮的指紋圖譜研究尚未見報道。目前，指紋圖譜結合模式識別方法已廣泛應用于中藥材的質量控制、來源分析及差異標志物篩選等方面，可有效對中藥材炮制前后的生品及制品進行判別分析和質量評價［11-13］。

本實驗對桑白皮和炒桑白皮指紋圖譜進行了比較研究，結合主成分分析PCA 和線性判斷分析LDA兩種降維分類方法，對其共有的化學組分進行數學分析，嘗試探索其化學組分的變化規律［14-16］，以期為桑白皮及炒桑白皮質量控制提供參考，給經典名方的研發提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器L-3000 型高效液相色譜儀（北京普源精電科技有限公司）；YMC Hydrosphere C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；CP225D 型電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；電子調溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）；Anke TDL-16G 型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；GR200B型高速粉碎機（合肥榮事達小家電有限公司）。

1.2 試藥桑皮苷A 對照品（成都德思特生物科技有限公司，批號：DST190408-068，純度≥98%）；桑根酮C 對照品（成都德思特生物科技有限公司，批號：DST180626-168，純度≥98%）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201415，純度≥96.2%）；桑辛素對照品（成都德思特生物科技有限公司，批號：DST180729-069,純度≥98%）；乙腈為色譜醇(RCIlabscan,批號：19050134）；三氟乙酸為分析純（天津科密歐化學試劑有限責任公司，批號：20190817）；水為哇哈哈純凈水。10 批桑白皮藥材經河北科技大學李建晨副教授鑒定為?？浦参锷５母稍锔?，樣品信息見表1。

表1 桑白皮樣品來源

1.3 方法

1.3.1 炮制品的制備 取桑白皮飲片（編號S1～S10），微火炒至表面微黃色或微具焦斑時，取出放涼，得炒桑白皮飲片（編號C1～C10）。分別取桑白皮和炒桑白皮飲片，粉碎，過一號篩，備用。

1.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取桑皮苷A 對照品約20 mg，綠原酸對照品約20 mg，桑根酮C 對照品約10 mg，桑辛素對照品20 mg，置于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液。各分別精密量取桑皮苷A 對照品儲備液、桑辛素對照品儲備液及綠原酸對照品儲備液1 mL，桑根酮C 對照儲備液2 mL 置10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照溶液，冷藏備用。

1.3.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取S1～S10，C1～C10 粉末各1.2 g（一號篩），置50 mL 錐形瓶中，精密加入80% 甲醇（體積比）30 mL，水浴回流60 min。過濾，濾液經離心半徑4 cm，3000 r/min離心5 min，取上清液過0.4 μm微孔濾膜即得相應的供試品溶液。

1.3.4 色譜條件 色譜柱：YMC Hydrosphere C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm；柱溫：30℃；進樣體積：20 μL；流動相：乙腈-水（0.5% 三氟乙酸），梯度洗脫，信號采集時間：105 min。見表2。

表2 流動相梯度變化

1.4 方法學考察

1.4.1 精密度試驗 取同一批炒桑白皮樣品（C3），按“1.3.3”項下方法進行制備，按“1.3.4”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）軟件進行數據分析，各色譜圖的相似度不低于0.995；選擇峰面積較大，分離度良好的以7號峰桑根酮C作為參照峰（S），計算各峰的相對保留時間和相對峰面積，結果其RSD 分別小于0.3% 和小于1.5%，符合指紋圖譜技術要求，表明儀器精密度良好。

1.4.2 重復性試驗 取同一批炒桑白皮樣品（C3）6 份，按“1.3.3”項下方法進行制備，按“1.3.4”項下色譜條件檢測指紋圖譜。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）軟件進行數據分析，各色譜圖的相似度不低于0.995；以7 號峰桑根酮C 為參照峰（S），計算各峰的相對保留時間和相對峰面積，結果其RSD 分別小于0.6%和1.2%，符合指紋圖譜技術要求，表明該方法重復性良好。

1.4.3 穩定性試驗 取同一批炒桑白皮供試品溶液（C3），于制備后的0、4、10、18、22、34、60 h 進樣檢測，按“1.3.4”項下色譜條件檢測指紋圖譜。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012版）軟件進行數據分析，結果顯示，各色譜圖的相似度不低于0.995；以7 號峰桑根酮C 為參照峰（S），分別計算各峰的相對保留時間和相對峰面積，結果其RSD 分別小于0.7% 和小于1.5%，表明供試品溶液在60 h內穩定性良好。

1.5 數據分析采用國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）軟件、SPSS 22.0 軟件及PAST 3 軟件對桑白皮及炒桑白皮HPLC的共有峰進行相似度評價、PCA及LDA分析。

2 結果與分析

2.1 指紋圖譜的建立將20 批桑白皮、炒桑白皮樣品，分別按照“2.3”項下方法制備各供試品溶液，按照“1.3.4”項下的色譜條件進行HPLC 測定與分析，采集105 min色譜圖，導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），分別以C4 和S4的圖譜為參照圖譜，采用平均數法，對其共有峰進行特征峰匹配，生成各自的對照圖譜，均有8 個共有峰。通過與對照品比對，指認出其中兩個成分，7號峰為桑根酮C，8號峰為桑辛素，選擇分離度良好，峰面積較大，保留時間適宜的7 號峰作為參照峰，分別計算其他共有峰的相對保留時間。見圖1—3和表3—4。

表3 炒桑白皮共有峰相對保留時間 min

圖1 混合對照品溶液HPLC圖

圖2 炒桑白皮HPLC指紋圖譜

圖3 桑白皮HPLC指紋圖譜

表4 桑白皮共有峰相對保留時間 min

2.2 相似度評價采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012版）對S1～10、C1～10樣品指紋圖譜進行相似度分析，可知桑白皮相似度為0.814～0.972，炒桑白皮相似度為0.819～0.972，從相似度波動情況看，炒桑白皮略小于桑白皮，特別是產地為安徽的4 批桑白皮，炒制后相似度差異小于炒制前。說明桑白皮炒制后化學成分發生了一定的變化，經炒制后整體品質趨于穩定和統一。見表5。

表5 桑白皮和炒桑白皮相似度

2.3 主成分分析（PCA）將S1～10、C1～10 樣品的色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件，根據共有峰匹配數據得到一個8×20的共有峰峰面積矩陣，對該數據進行PCA分析，得到主成分的特征值及載荷矩陣。見表6—8。

表6 桑白皮和炒桑白皮共有峰峰面積 mV

表7 桑白皮和炒桑白皮的PCA特征值

表8 桑白皮和炒桑白皮的因子載荷矩陣

選取前兩個特征值＞1 的成分為主成分，其方差累計貢獻值為76.186%，說明前4個因子在反映桑白皮炒制前后與8 個共有成分的相互關系中起主導作用，能夠評價桑白皮生品與炒制品的品質。其中，第1 主成分的獨立貢獻率為48.469%，主要代表第2、3、4、5共有峰的信息，主成分2主要代表第1、6、7、8 共有峰的信息。表明通過PCA 分析降維處理后所提取的主成分能夠代表桑白皮指紋圖譜中8 個共有峰的主要信息。對前2 個主成分計算得到桑白皮及其炒制品的主成分得分，以主成分1 和主成分2 的得分分別作為X軸和Y軸，得到桑白皮及其炒制品的PCA 投影?？梢娚０灼づc炒桑白皮未完全分開，存在一定的交叉。S1 和C1，S2和C2，S4和C4，S5和C5的距離較近，說明這幾批藥材炒制前后變化較小，而其余批次的生品與炒制品距離較遠，炒制前后產生的變化較大。把桑白皮和炒桑白皮分別做了凸多邊形處理，桑白皮所圍成的區域面積略大于炒桑白皮所圍成的面積，說明桑白皮批次間的差異略大于炒桑白皮批次間差異。見圖4。

圖4 桑白皮和炒桑白皮的PCA得分投影圖

2.4 線性判別分析（LDA）

2.4.1 桑白皮與炒桑白皮炒制前后線性判別 將表6中共有峰數據分為兩組，組1（炒桑白皮），組2（桑白皮），進行線性判別分析，所得模型的準確率為90%，內部交叉驗證準確率為45%。

2.4.2 不同產地桑白皮和炒桑白皮的線性判別 將S1～10、C1～10 樣品按產地分為5 組進行LDA 分析，所得模型的分類結果準確率為95%，內部交叉驗證準確率為55%。共得到4 個判別式函數，前兩個函數的方差貢獻率累積92.2%，計算桑白皮及其炒制品每一批次在函數1 和函數2 的判別得分，以函數1 為X 軸，函數2 的得分為Y 軸，得到LDA投影圖，見圖5。

圖5 桑白皮和炒桑白皮的LDA分析

可見主成分-線性判別模型對于炒制前后的桑白皮的預測區別精確度低。無法通過主成分-線性判別分析法對二者進行有效區分。

3 討論

本試驗比較了4 個流動相體系：乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.5%醋酸水、乙腈-0.5%三氟乙酸水。結果表明，乙腈-0.5% 三氟乙酸水系統為流動相時，各色譜峰分離效果較好，峰型對稱且穩定，因此選擇乙腈-0.5% 三氟乙酸水系統為流動相。

相似度、PCA及LDA模型三者均可用于桑白皮質量評價分析。桑白皮和炒桑白皮相似度均大于0.80，說明各自組內具有較高的相似性；PCA 和LDA 投影圖可見桑白皮和炒桑白皮互相交錯的情況，嘗試建立的LDA 模型準確率較小，說明這些樣品在多個維度上具有較高的相似性，不易找到合適的區分方法，這可能與樣品的處理方法有關，目前正在采用冷提取的方式進行研究。

通過本研究結果可知，桑白皮和炒桑白皮二者的指紋圖譜保留時間變化不大，峰的個數無明顯差異，共有峰的峰面積在炒制前后有所改變，經炒制后整體品質趨向于統一，說明炒制對桑白皮有一定作用，但無明顯的趨勢呈現，這與李群等［17］對于桑白皮蜜炙前后的指紋圖譜研究結果高度相似。桑白皮中發揮止咳平喘作用的關鍵化合物是東莨菪內酯，徐小飛等［18］發現蜜炙后東莨菪內酯質量分數略有增加，而李群等［17］的研究得出相反結論，發現蜜炙后東莨菪內酯呈下降趨勢，提示應結合含量測定對炒桑白皮炮制工藝作進一步深入研究。有文獻顯示，桑白皮炒制性寒偏平，降氣平喘力勝，多用于水飲停肺。蜜炙藥味甘，性寒偏潤，潤肺清熱，止咳平喘力強，多用于肺熱咳喘［18-19］。提示需通過藥理作用來探究經典名方瀉白散中使用“蜜桑白皮”和“炒桑白皮”的合理性。

本試驗以安徽產桑白皮為主要采集品種，同時收集了四川、河南、河北、安徽等地共10 批樣品，涵蓋了主產區和道地產區，在產地和質量方面具有代表性。本試驗建立了桑白皮及炒桑白皮二者的指紋圖譜，并同時進行PCA及LDA分析。探索桑白皮炒制前后的質量變化規律。雖然目前發現二者在化學成分上有較大一致性。但指紋圖譜專屬性較強，測定方法簡便準確，重復性較好，對探索瀉白散的桑白皮炒制炮制方式仍有一定的參考意義。而確定炒桑白皮炮制的具體工藝條件對規范炮制方法、提高經典名方瀉白散質量非常重要，本課題將進一步深入研究。