液相色譜-串聯質譜法測定固體及液體藥物中27種新型毒品芬太尼類物質

羅 耀，張建瑩，黃昌雄，卞學海，李 穎，梁淑雯

(深圳海關 食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045)

芬太尼(Fentanyl)是從阿片(罌粟)中提取的生物堿及衍生物，是一種強效麻醉性鎮痛藥，其麻醉效力比海洛因強50倍，比嗎啡強100倍。但其也是一種成癮性毒品，2 mg的藥量足以致命。而且這類化學非法合成毒品易出現各種變體，例如芬太尼目前已知的變體有130多種。芬太尼類物質是指化學結構與芬太尼相比，符合以下1個或多個條件的物質：①使用其他?；娲；?；②使用任何取代或未取代的單環芳香基團替代與氮原子直接相連的苯基；③哌啶環上存在烷基、烯基、烷氧基、酯基、醚基、羥基、鹵素、鹵代烷基、氨基及硝基等取代基；④使用其他任意基團(氫原子除外)替代苯乙基。圖1為5種典型芬太尼類物質的化學結構式。芬太尼類物質(Fentanyl analogs and metabolites)是新精神活性物質(New psychoactive substances，NPS)的重要組成部分。新精神活性物質又稱“策劃藥”或“實驗室毒品”，是繼傳統毒品、合成毒品后全球流行的第3代毒品。

圖1 5種典型芬太尼類物質的化學結構式Fig.1 Chemical structures of typical fentanyl analogs and metabolites

據報道，自2013年以來，海洛因和假藥配方中分別發現了非法芬太尼及其類似物，隨后緝獲的藥物材料和毒理學案例中發現的此類物質數量急劇增加，2016年芬太尼及其類似物的致死人數超過海洛因[1]。由于該類物質的毒性強、品種多、變異快、緝查難，已成為當前國際禁毒領域面臨的一大難題。我國禁毒主管部門對芬太尼類物質采取非常嚴格的監管措施，列管品種達25種，超過了聯合國規定管制的21種。2019年4月我國首次將芬太尼整類物質列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》，按類納入毒品管制范疇。為滿足新形勢下芬太尼類物質的列管要求，助力海關打擊毒品犯罪，急需建立芬太尼類物質的定性定量方法。

目前，芬太尼類物質的檢測方法有酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[1]、高效液相色譜法(HPLC)及液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[2-15]，主要針對芬太尼、瑞芬太尼、舒芬太尼等單一物質進行分析，涉及血液、乳汁、尿液、唾液等生物基質。聯合國毒品與犯罪問題辦公室推薦的方法中，GC-MS法僅涉及3種芬太尼類物質[1]，液相色譜-高分辨質譜法(LC-HRMS)亦只涉及10多種芬太尼類物質的篩查檢測[1]。針對廣泛的非法和處方芬太尼類物質的LC-MS/MS檢測方法報道較少，導致處方芬太尼類藥物的過量流行和非法芬太尼類藥物的出現。本研究通過75%乙腈水結合乙腈提取固、液體藥物中的芬太尼類物質，兩類藥物分別采用HLB固相萃取小柱及QuEChERS法凈化，液相色譜-串聯質譜測定，建立了固體和液體藥物中27種新型毒品芬太尼類物質(包括芬太尼及26種類似物或代謝物)的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Endura LC-MS/MS液相色譜-串聯質譜儀(配Ultimate 3000超高效液相色譜儀，Thermofisher公司)，Rax top渦旋振蕩儀(德國Heidolph公司)；3K18高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；高純水發生器(Milli-Q Integral 10+，美國Millipore公司)；0.22 μm 親水PTFE有機濾膜(上海安譜公司)。 甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨(色譜純，德國Merck公司)；實驗用水為Milli-Q超純水；Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL，美國Waters公司)；N-丙基乙二胺吸附劑(PSA，美國Supelco公司)。27種芬太尼類物質標準溶液(化合物名稱見表1，質量濃度100 mg/L，美國Cerilliant公司)，使用乙腈稀釋為1.00 mg/L和100 μg/L的混合標準工作溶液，于-18 ℃避光存放。

1.2 樣品處理

1.2.1 固體藥物粉末稱取固體試樣0.100 g，加入2 mL 75%乙腈水，渦旋溶解，再加入2 mL 乙腈，渦旋30 s，超聲提取15 min。9 500 r/min 離心5 min后，吸取全部上清液于HLB固相萃取柱(預先用5 mL乙腈活化)中，待上清液全部流出，再加入4 mL乙腈淋洗。收集所有流出液，40 ℃水浴氮吹至低于0.5 mL，加入0.5 mL水，再以乙腈定容至1.00 mL，渦旋振蕩30 s，9 500 r/min 離心5 min。取上清液，過0.22 μm有機濾膜后，上機測定。

1.2.2 液體藥物稱取液體試樣0.100 mL，加入2 mL 75%乙腈水，渦旋溶解，再加入2 mL 乙腈，渦旋30 s，超聲提取15 min。加入25 mg PSA，渦旋1 min，9 500 r/min 離心5 min。吸取所有上清液，40 ℃水浴氮吹至低于0.5 mL，加入0.5 mL水，再用乙腈定容至1.00 mL，渦旋振蕩30 s，9 500 r/min 離心5 min。取上清液，過0.22 μm有機濾膜后，上機測定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus Phenyl-Hexyl(150 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國Agilent公司)。流動相：A為0.005 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)；B為甲醇(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序：0～1.0 min，5% B；1.0～40 min，5%～55% B；40～45 min，55% B；45～45.5 min，55%～5% B；45.5～50 min，5% B。流速：0.3 mL/min;進樣量：2 μL。

1.4 質譜條件

離子化模式：電噴霧離子源(ESI)，溫度：150 ℃；正離子模式；質譜掃描方式：多反應監測(MRM)；毛細管溫度：350 ℃；霧化器溫度：350 ℃；鞘氣壓力：35 Arb(Arbitrary units)；輔助氣壓力：8 Arb；分辨率：單位分辨率；駐留時間：30 ms。其它質譜參數見表1。

表1 27種化合物的質譜參數Table 1 MS parameters for the detection of 27 compounds

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

由于芬太尼類物質含有苯基、烷基和酰胺等基團，化學性質差異較大，且同時存在部分同分異構體，因此本方法采用苯基-己基色譜柱Eclipse Plus Phenyl-Hexyl(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，當使用含甲醇的流動相時，對極性胺類化合物和芳香族化合物有顯著的選擇性。結果表明，27種芬太尼類物質均得到較好的分離和保留，其中包括2對同分異構體(4-氟異丁酰芬太尼和4-氟丁酰芬太尼，丁酰芬太尼和對氟芬太尼)。

圖2 止咳水基質加標樣品(10.0 μg/L)的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of the spiked(10.0 μg/L) cough syrup samples the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2 流動相的選擇

實驗對比了甲醇(含0.05%甲酸)-0.005 mol/L乙酸銨(pH 3.0)、甲醇(含0.1%甲酸)-0.005 mol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)、乙腈(含0.1%甲酸)-0.005 mol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)、甲醇(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸水、乙腈(含0.1%甲酸)-0.05%甲酸水5種流動相的色譜分離效果。結果顯示，相較于在流動相中加入0.05%甲酸，加入0.1%甲酸有利于提高分析物的離子化效率并改善色譜峰形，而加入乙酸銨可起到緩沖鹽的作用。由于乙腈的洗脫能力較強，不利于4種同分異構體的分離，最終實驗確定以甲醇(含0.1%甲酸)-0.005 mol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)作為流動相，并優化了最佳洗脫程序。在“1.3”條件下，27種目標化合物均可得到較好的分離度和峰形。止咳水基質加標樣品(質量濃度為10.0 μg/L)中27種目標化合物的MRM色譜圖見圖2。

2.3 樣品前處理方法的優化

2.3.1 提取溶劑的選擇根據溶劑性質、芬太尼類物質性質、樣品基質特點和檢測靈敏度的要求及濃縮需要，本方法選擇乙腈水溶液作為提取溶劑。分別考察了50%乙腈水、75%乙腈水、100%乙腈作為提取溶劑時，固體、液體藥物樣品中27種目標化合物的回收率。結果表明，乙腈中加適量水可增加固體藥物的溶解度，提高目標化合物的提取效率；但加入過多水分不利于樣液的濃縮。綜合考慮，選取2 mL 75%乙腈水+2 mL 乙腈為提取溶劑。

2.3.2 HLB凈化柱洗脫液用量的選擇HLB固相萃取柱填料是親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮單體按一定比例組成的大孔共聚物。芬太尼類物質大多為弱極性，而固體類試樣干擾物一般為淀粉、糊精、纖維素、色素以及固體賦型顆粒。本實驗采用HLB固相萃取柱作為正相柱，吸附弱極性至中等極性的酸性、中性、堿性化合物以凈化固體樣品。

分別比較了洗脫液乙腈的不同用量(1、2、3、4、5 mL)對27種目標化合物回收率的影響。結果表明，乙腈洗脫量為4 mL時，27種目標化合物的總體回收率較好(為73.3%～83.3%)，因此選擇洗脫液乙腈的用量為4 mL。

圖3 PSA用量對目標化合物回收率的影響Fig.3 Effect of PSA dosage on recoveries of analytes

2.3.3 PSA吸附劑用量的選擇PSA是在高純硅膠基質上鍵合N-丙基乙二胺的極性吸附劑，無端基封尾，主要保留機理為弱陰離子交換(水溶性基質)、極性吸附(非極性有機基質)、螯合作用，能有效去除基質中的許多極性物質(如色素、有機酸、糖等)。液體類試樣主要為有機酸、糖分、色素、維生素等，因此液體藥物采用PSA凈化。

分別比較了不同PSA用量(20、25、30、35、40 mg)對27種目標化合物回收率的影響。結果表明，在上述PSA用量下，除了N-苯乙基-4-哌替啶酮、4-苯胺基-N-苯乙基哌啶(4-ANPP)等的回收率略有偏差外，絕大部分化合物的回收率均大于70%(見圖3)。綜合考慮，選取PSA添加量為25 mg。

2.4 基質效應

基質效應(ME)是指不同的樣品基質在質譜檢測(特別是使用電離源)時由于離子化效應而產生的離子增強或抑制作用。其計算公式為ME=Ka/Kb，其中Ka為樣品基質的校準曲線斜率，Kb為溶劑校準曲線的斜率。當ME接近100%時，表明無明顯的基質效應；大于100%時，表明存在基質增強效應；小于100%，則說明存在基質抑制效應。實驗考察了頭痛粉、止咳水樣品的基質效應，分別采用純溶劑和基質提取液配制標準曲線工作溶液，按照本方法進行測定得到目標物的溶劑和樣品基質匹配標準曲線方程，并計算基質效應。結果顯示，頭痛粉和止咳水樣品的ME值為105%～130%，存在較低的基質效應。因此，本方法采用溶劑配制標準工作曲線溶液。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性方程與定量下限在優化實驗條件下，以50%乙腈水溶液稀釋混合標準儲備溶液，配成質量濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L的混合標準工作溶液，采用本方法進行測定，并以峰面積對各組分的質量濃度繪制工作曲線。結果表明，27種目標化合物的質量濃度在0.5～50.0 μg/L范圍內與其定量離子的響應峰面積呈良好線性關系，相關系數(r2)均大于0.99(見表2)。

基于回收率和相對標準偏差(RSD)滿足歐盟SANTE/11813/2017要求的最低加標水平[16]，以及加標樣品的定量離子對色譜峰信號10倍信噪比(S/N)的要求，并結合國內外的殘留限量要求，確定27種目標化合物在固體藥物中的定量下限均為10.0 μg/kg，液體藥物中均為10.0 μg/L。

2.5.2 準確度與精密度采用空白的頭痛粉和止咳水作為驗證基體，加標水平為10.0、20.0、50.0 μg/kg(μg/L)，每個水平做6個平行。按本方法進行測定，外標法定量，計算每種化合物的平均回收率及RSD。結果表明，27種芬太尼類物質在頭痛粉中3個加標水平下的平均回收率為84.8% ～106%，RSD為1.1% ～7.8%；在止咳水中的平均回收率為86.9% ～109%，RSD為0.86% ～8.5%(見表2)。

表2 27種芬太尼類物質的線性方程、相關系數、回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Regression equations,correlation coefficients(r2),recoveries and relative standard deviations of 27 compounds(n=6)

Y：peak area；X：mass concentration，μg/L

2.6 實際樣品檢測

應用所建立的分析方法對3份芬太尼注射液樣品進行檢測，均檢出高濃度芬太尼，質量濃度分別為47.1、47.8、48.1 mg/L。

3 結 論

本文采用75%乙腈水溶液結合乙腈提取固體和液體藥物中27種芬太尼類物質，固體藥物提取液經HLB固相萃取柱凈化，液體藥物提取液經QuEChERS法凈化后，采用液相色譜-串聯質譜測定。該法操作簡便，耗時短，溶劑用量少，靈敏度高，穩定性好；具有較高的回收率、良好的精密度和較低的定量下限，適用于頭痛粉、止咳水等藥物中芬太尼類物質的定性及定量檢測，滿足公安緝毒、刑偵及相關檢測部門對芬太尼監控的檢測技術要求，具有迫切的現實應用價值。