HPLC-MS/MS法同時測定動物源性食品中9種吡咯里西啶類生物堿的含量

姜 冰，丁 濤，曹崇江，寧曉盼，吳 斌，唐茂芝，王茂華

(1.中國藥科大學 工學院，江蘇 南京 211198；2.南京海關動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210001；3.國家市場監督管理總局認證認可技術研究中心，北京 100020)

吡咯里西啶類生物堿(Pyrrolizidine alkaloids,PAs)是廣泛存在于植物中的含氮堿性化合物，可引起人和牲畜的肝毒性，尤其是PAs的代謝活化產物具有肝臟損傷、致癌和致發育等多種毒性作用[1-2]。PAs對哺乳動物本身并無明顯毒性，當肝臟的正常氧化解毒機制將其轉化為吡咯代謝產物(脫氫生物堿)時，它們作為食物或飼料成分時的危害開始產生[3]。因此，PAs的中毒案例時有發生。動物源性食品如蜂蜜、牛奶、雞蛋和動物內臟很容易含有PAs，蜂蜜中檢出PAs在國內外均有報道[4-7]。Bodi等[8]在中草藥和茶葉中檢出較高含量的PAs，但對于動物源性食品中是否含有PAs及其含量檢測的研究仍較為缺乏。

對于PAs的檢測方法通常有分光光度法[9]、薄層色譜法[10]、核磁共振法[11]、免疫學方法[12]、高效液相色譜法[13]、氣相色譜-串聯質譜法[14]、高效液相色譜-串聯質譜法[15]等。分光光度法和薄層色譜法對復雜基質中PAs的痕量分析缺乏敏感性和選擇性；氣相色譜法也存在熱分解不穩定等不足；而免疫學方法通常只對結構上緊密相關的一小部分PAs敏感[16]。隨著液相色譜-質譜儀器檢測能力的不斷提高，該聯用技術在天然產物分析中的應用日益廣泛，極大地有助于對復雜基質中痕量天然產物的明確識別和定量，被應用于多種PAs的同時檢測[17-19]。近年來，陸續有研究人員通過固相萃取凈化/液相色譜-串聯質譜法開展PAs的檢測分析[20-22]。

本文通過MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-質譜/質譜法測定，建立了同時定量測定蜂蜜、乳制品、動物內臟等動物源性食品中倒千里光堿、野百合堿、千里光菲靈堿、千里光寧堿、克氏千里光寧堿、立可沙明堿、天芥菜堿、毛果天芥菜堿、藍薊定9種PAs(如圖1所示)含量的方法，并進行系統的方法學考察和實際樣品分析。該方法具有樣品制備簡單和用量少、所需試劑少、靈敏度高、穩定性好等特點，可實現動物源性食品中PAs的快速和高效準確測定。

圖1 9種PAs的分子結構式Fig.1 Molecule structures of 9 PAs

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB Sciex QTRAP 4500 LC-MS/MS系統(美國AB SCIEX公司)，Smart N15VF超純水系統(力康生物公司)，WH-3微型渦旋混合儀(上海滬西公司)，SIGMA 2-16PK型高速冷凍離心機(北京博勵行公司)，MSE 125P型分析天平(德國Sartorius公司)，KH-500SP雙頻數控超聲波清洗器(禾創超聲公司)，SPE432型全自動固相萃取儀(普立泰科公司)，Auto Vap s60型氮吹濃縮儀(美國ATR公司)。

甲醇(色譜純，美國Honeywell公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；MCX固相萃取柱、HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg，Waters公司)。

標準物質：野百合堿(純度100%)、立可沙明堿(純度100%)、倒千里光堿(純度99.8%)、天芥菜堿(純度90.98%)、千里光菲靈堿(純度99.78%)、千里光寧堿(純度100%)、藍薊定(純度96.62%)、克氏千里光寧堿(純度97.16%)、毛果天芥菜堿(純度98.4%)均購于上海安譜實驗科技股份有限公司。用甲醇將各生物堿標準品溶解，稀釋并定容獲得1 mg/mL標準儲備液，根據需要用甲醇將其儲備液稀釋至10 μg/mL作為中間工作儲備液。

1.2 實驗部分

1.2.1 蜂蜜樣品的提取稱取2 g(精確至0.01 g)試樣置于50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 0.05 mol/L鹽酸提取溶液，加入1 mL三氯甲烷去蛋白，渦旋混合均勻，8 000 r/min離心3 min，取上清液準備凈化。

1.2.2 乳制品樣品的提取稱取5 g(精確至0.01 g)樣品置于50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中(乳粉樣品加入5 mL水)，加入10 mL 5%三氯乙酸，渦旋混合均勻，8 000 r/min離心3 min，過濾(定性濾紙)后準備凈化。

1.2.3 動物肝臟樣品的提取稱取1 g(精確至0.01 g)樣品置于50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈，渦旋混合均勻，超聲提取20 min，8 000 r/min離心3 min，過濾(定性濾紙)后準備凈化。

1.2.4 樣品凈化將上述待凈化樣品轉移至Waters Oasis MCX固相萃取柱(預先用5 mL甲醇和5 mL水活化)中，棄去廢液，依次用5 mL水和3 mL甲醇淋洗，加入5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液于40 ℃下氮氣吹干，用1.0 mL甲醇-水(1∶9，體積比)溶液復溶，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

1.2.5 色譜參數色譜柱：Phenomenex Kinetex C18(4.6 mm× 100 mm，2.6 μm)；流動相：甲醇(A)-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨(B)；流速：0.5 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；流動相梯度洗脫程序：0～3.5 min，10% A；3.5～6.5 min，10%～90% A；6.5～10.0 min，90% A；10.0～10.1 min，90%～10% A；10.1～13.0 min，10% A。

1.2.6 質譜參數離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子掃描；監測方式：多反應監測(MRM)；電噴霧電壓(IS)：5 500 V；霧化氣壓力(GS1)：379 kPa(55 psi)；氣簾氣壓力(GS2)：379 kPa(55 psi)；輔助氣壓力(CUR)：241 kPa(35 psi)；離子源溫度(TEM)：550 ℃；其它質譜參數如表1所示。

表1 9種PAs的質譜參數Table 1 MS parameters of 9 PAs

*:quantitation ion

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

PAs的化學結構為含氮的堿性環狀結構，因此采用C18反相色譜柱，正離子多反應監測(MRM)模式進行分離和測定。本文考察了4種不同流動相(甲醇-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨)的分離效果。實驗結果顯示使用甲酸酸化的水相體系可使峰形更尖銳，峰形改善明顯。由于使用甲醇配制PAs標準溶液，因此選擇甲醇做流動相的分離效果優于乙腈。本文最終選擇甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨作為流動相。按“1.2.5”進行梯度洗脫，9種PAs標準溶液(200 μg/L)的總離子流圖及各PAs的選擇離子流圖如圖2所示。

2.2 質譜條件的考察

對PAs標準溶液分別進行稀釋，并采用流動注射方式在正離子模式下進行母離子全掃描，確定分子離子峰，再分別以待測化合物的分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描。選擇兩個特征子離子，其中以信噪比高、峰形好、干擾小的離子對作為定量離子對。以多反應監測正離子模式優化各種質譜參數，獲得的最佳質譜參數見表1。

圖2 9種PAs標準溶液(200 μg/L)的總離子圖及選擇離子流圖Fig.2 Total ion and selected ion chromatograms of 9 PAs standard solutions(200 μg/L)

圖3 不同固相萃取柱對9種PAs的凈化效果Fig.3 Purification results of 9 PAs by different solid phase extraction columns

2.3 提取條件的選擇

考察了不同溶劑對不同基質的去蛋白效果以及不同體積提取液的提取效果。對于蜂蜜基質，三氯甲烷的去蛋白效果明顯優于5%三氯乙酸，而乳制品采用5%三氯乙酸的去蛋白效果較好，對于動物肝臟，提取液1%乙酸乙腈本身具有去蛋白效果，因此無需另加三氯甲烷或三氯乙酸去蛋白。測試了不同提取液體積(5、10、15 mL)對基質的提取效果，結果表明，采用5 mL提取液進行提取時，PAs的回收率較低，由于15 mL和10 mL提取液的回收率差別不大，為了減少提取溶液的使用量，最終選擇10 mL提取液。

2.4 固相萃取凈化的選擇

液相色譜-質譜/質譜法進行定量測定時，通常采用液-液萃取、固相萃取等凈化方式降低背景干擾，減少基質效應，提高檢測結果的準確性。本實驗考察了基于改性聚合物固相萃取柱(Waters Oasis HLB，60 mg/3 mL)和強陽離子固相萃取柱(Waters Oasis MCX)兩種類型固相萃取柱的凈化效果，在0.05 mol/L鹽酸溶液中加入混合標準溶液并轉移至活化的固相萃取柱，HLB小柱通過5 mL水淋洗，5 mL甲醇洗脫的方式進行凈化，MCX小柱通過水和甲醇一次淋洗，5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫的方式進行凈化。結果如圖3所示，天芥菜堿、千里光菲靈堿、千里光寧堿、克氏千里光寧堿、毛果天芥菜堿、藍薊定在兩種固相萃取柱的回收率均大于70%，然而野百合堿、立可沙明堿和倒千里光堿在采用HLB固相萃取柱時凈化回收率小于60%。此外，由于PAs在酸性條件下其叔胺基團易形成陽離子，因此，最終采用強陽離子固相萃取柱(Waters Oasis MCX)進行富集和凈化。

2.5 基質效應

基質效應對待測組分在儀器中的響應信號會有不同程度的抑制或增強，使檢測方法的檢出限、定量下限和精密度等受到影響[23]。本文采取提取后添加法考察了蜂蜜、乳制品及動物肝臟中基質抑制效應的影響程度，基質效應(ME)計算如下：ME=A/B×100%，其中A為空白基質中標準物質的峰面積，B為甲醇中標準物質的峰面積?；|抑制時，ME<1；基質增強時，ME>1。實驗結果表明，9種待測生物堿在蜂蜜、乳制品和動物肝臟基質中的ME為0.42～0.83。為消除基質效應的影響，本實驗采用基質匹配標準工作溶液外標法進行定量，即樣品溶液和標準溶液均采用空白樣品的提取液作為稀釋液，使其均具有相同的離子化條件。

2.6 線性關系、回收率與定量下限

在基質溶液中添加混合標準工作液，使其質量濃度分別為0、10、20、50、100 ng/mL，在優化實驗條件下考察了9種PAs的線性關系。結果顯示，9種PAs在0～100 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好(r>0.99)。以信噪比(S/N)大于3為方法檢出限(LOD),信噪比(S/N)大于10且回收率和精密度較好的最低加標濃度為方法定量下限(LOQ)，得到9種PAs的LOD均為3 μg/kg,LOQ均為10 μg/kg。對洋槐蜜、麥盧卡蜂蜜、液態乳、乳粉及雞肝等動物源性食品分別進行3個水平(10、20、50 μg/kg)的加標回收率測定，每個水平平行測定6次。由表2可知，9種PAs在不同加標水平的回收率為71.0%～103%，相對標準偏差(RSD)為3.0%～9.8%。不同品種的蜂蜜加標回收率有所不同，麥盧卡蜂蜜相對洋槐蜜的加標回收率較低；對于乳制品，液態乳的加標回收率相對高于固態奶粉的回收率。同種基質中不同PAs的加標回收率也有區別，譬如，在洋槐蜜中千里光寧堿和藍薊定的加標回收率相對較高。

表2 5種不同種類基質中9種PAs的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of nine PAs spiked in 5 kinds of samples(n=6)

the number denoted was the same as that in Table 1

2.7 實際樣品的分析

采用本方法對21種蜂蜜、16種乳制品和3種動物肝臟中的9種PAs進行檢測。結果發現，大部分樣品均未檢出或檢出含量較小，而在麥盧卡蜂蜜中檢出立可沙明堿、天芥菜堿、千里光菲靈堿、藍薊定和毛果天芥菜堿，含量為3.4～8.9 μg/kg。

3 結 論

本文通過酸性溶液提取，MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-質譜/質譜法檢測，外標法定量，實現了對蜂蜜、乳制品、動物內臟等動物源性食品中9種PAs含量的同時測定。該方法具有樣品與試劑用量少、操作簡單、靈敏度高、重復性好等特點。選取的基質對方法雖具有一定干擾，但使用基質匹配標準曲線法后，回收率高，適用于蜂蜜、乳制品、肝臟等動物源性食品中9種PAs的測定。