超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定畜禽產品中15種鎮靜類藥物殘留

王 京，葉佳明，王 瀟，鐘世歡，陳青俊

（1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州 310030；2.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 311305）

0 引言

隨著我國經濟的飛速發展和生活水平的不斷提高，人們對肉制品、奶制品和魚制品等動物性食品的品質要求也越來越高，然而為了預防或治療畜禽、提高產量而大量投入化學藥物造成藥物殘留于動物組織中，伴隨而來的是對公眾健康和環境的潛在危害。近年來食品安全事件頻發，對食品的獸藥殘留引起了普遍關注，并認為獸藥殘留將是今后食品安全性中重要問題之一[1-2]。鎮靜類藥物可用于抗暈眩、鎮吐等，飼料中添加此類藥物，能興奮攝食中樞，不法商人在動物養殖過程中非法使用，以達到增加動物采食、促進生長、增加體重等作用；另外，使用該藥物可降低動物運輸過程中的死亡率。2012年在對動物源性食品鎮靜類藥物及其代謝物殘留量普查時發現，35%的豬肉內都含有微量異丙嗪亞砜。殘留的氯丙嗪、異丙嗪和部分具有原藥活性的代謝物，能引起白細胞減少和粒細胞缺乏癥，從而引起人體肝臟、腎臟的病變，還會引起眼部并發癥等[3]。目前鎮靜類藥物在養殖業中的使用已經引起了美國、歐盟和日本等國家的高度重視。日本厚生勞動省于2005年6月21日，向各世界貿易組織（WTO） 成員通報了“臨時最大殘留限量標準”“一律基準”“豁免物質”最終草案-G/SPS/N/JPN/145。其中，9種動物源性產品評估表將鎮靜類藥物中的氯丙嗪列為“高貿易影響程度”的藥物，明確規定在動物源性食品中該類藥物及其代謝產物均不得檢出[4]。

目前，有關畜禽產品中多種鎮靜類藥物的測定方法還較少，僅有一些少量文獻與異丙嗪、氯丙嗪及其代謝物相關，大部分研究局限于法醫學方面。近些年，國內外對于該類藥物的檢測主要采用LCMS/MS法[5-7]和GC-MS法，有研究人員利用GC/MS測定豬肝中的氯丙嗪殘留量，RSD＞5%，精密度不理想[8-9]；2008年發布的國家標準NY/T 1458—2007的檢出限為 0.2～1.0 mg/kg，靈敏度不高[10]；Yadollah Yamini等人[11]將磁性固相萃取技術（MSPE） 與高效液相色譜技術（HPLC）聯用測定水、尿、血漿中的痕量氯丙嗪含量，樣品對象主要為血液和尿液，相對食品樣品基質比較干凈；Jessica J W Broeders等人[12]用HPLC-MS/MS測定類似藥物在豬腎等中的殘留，藥物種類較少且方法適應性不理想。目前尚無對同時測定畜禽肉中15種鎮靜類藥物的共同研究。旨在建立一種利用簡單快速的分散固相萃取凈化方法，基于超高效液相色譜-串聯質譜（UPLCMS/MS）技術，實現同時測定15種鎮靜類藥物殘留。該方法簡便快速，靈敏度、精密度和準確度滿足實際樣品的檢測需要。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260Ⅱ型超高效液相色譜-6470三重四極桿質譜聯用儀，美國Agilent公司產品；Centrifuge 5804R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司產品；MS2型旋渦振蕩器，德國IKA公司產品；AS 3120型超聲波振蕩器，天津特賽恩斯儀器有限公司產品；N-EVAP112型水浴式氮吹儀，美國Organomation公司產品；Millipore-iQ型高純水凈化儀，美國Millipore公司產品。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸為色譜純，德國MERCK公司提供；硫酸鎂、氯化鈉、EDTA為分析純，上海凌峰化學試劑有限公司提供；二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（HLB）） 吸附劑，美國Waters公司提供；實驗用水，Millipore-iQ高純水凈化儀制得。

15種鎮靜類藥物標準物質（特非那定、西替利嗪、賽庚定、氯雷他定、地氯雷他定、阿司咪唑、氯丙嗪、異丙嗪、氟奮乃靜、氯苯那敏、奮乃靜羥嗪、溴苯那敏、曲吡那敏、苯海拉明），德國Dr.Ehrenstorfer公司提供。

1.2 標準溶液的配制

將15種鎮靜類藥物標準物質用乙腈分別配制成100 μg/mL左右質量濃度的儲備液，-18℃條件下避光保存；按需要用初始比例的流動相稀釋成適當質量濃度的混合標準工作液，臨用配制。

1.3 預處理方法

準確稱取制備均勻的試樣5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，準確加入20.0 mL的混合提取液（乙酸乙酯∶乙腈提取液=20∶80），勻漿1 min后超聲提取10 min，以轉速8 000 r/min離心3 min，取上清液加入1 g二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物吸附劑，渦旋1 min后靜置，取全部清液加入5 g鹽析劑（NaCl∶MgSO4為1∶4），渦旋1 min后以轉速8 000 r/min于4℃下低溫離心3 min；取上清液在40℃水浴中氮吹至近干，加入2.0 mL初始比例的流動相（含0.1 mol/L EDTA） 復溶，過0.22 μm濾膜供LC-MS/MS測定。

1.4 標準曲線的制備

取同類陰性樣品，按照1.3方法處理濃縮至近干，加入1.2配制的標準混合工作液2.0 mL，按1.3方法繼續操作即得。

1.5 UPLC-MS/MS測定

液相色譜條件：Poroshell 120 EC-C18柱（100 mmL×2.1 mm ID，2.7 μm），柱溫35℃，流速0.25 mL/min，進樣量2 μL，流動相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序0～3 min，10%～10%B；3～6 min，10%～30%B；6～8 min，30%～40%B；8～12 min，40%～70%B；12～14 min，70%～90%B；14～16 min，90%～90%B；16～16.1 min，90%～10%B。

質譜條件：電噴霧離子源正離子掃描模式（ESI+），干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度300℃，鞘氣流速15 L/min，鞘氣溫度250℃，霧化器壓力30 psi，毛細管電壓4 500 V，質譜分辨率為unit，動態多反應監測（DMRM）模式采集。

15種藥物的質譜采集參數見表1。

定量方法：先取1.4制備的溶液2 μL上機測定制作標準曲線，再取1.3制得的樣液2 μL上機測定，結合色譜保留時間和2對特征離子對定性，通過定量子離子的峰面積計算樣液中目標物的含量。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

表1 15種藥物的質譜采集參數

在電噴霧離子源正離子全掃描（ESI+SCAN） 模式下分別對15種1 μg/mL質量濃度的鎮靜類藥物進行分析，15種化合物均能形成穩定的【M+H】+形式準分子離子峰。在單離子掃描（SIM）模式下分別優化各化合物的裂解電壓（Fragmentor）使各自母離子響應值最大，在子離子掃描（Product Ion）模式和多反應監測（MRM） 模式分析中，確定2對特征離子對供定性用，其中豐度較高的一對特征離子對供定量用，并優化其碰撞能（CE）使子離子響應值最大。為了保證質譜檢測的靈敏度和重現性，試驗采用動態多反應監測模式（DMRM）進行數據采集，動態多反應監測模式可以根據不同化合物的保留時間，分段進行MRM掃描，以增加單一目標化合物的掃描駐留時間（Dwell），加大目標離子碎片的通量提高數據采集效率。

2.2 色譜條件的優化

西替利嗪和羥嗪、氯丙嗪和異丙嗪、氟奮乃靜和奮乃靜具有相同結構的母核，具有相似的二級質譜碎片，準確定量必須保證在液相色譜上的分離度。研究從儀器損耗、分析時間和分離效果角度出發，主要對比了XBridge C18柱（100 mmL×2.1 mm ID，1.7 μm）、Poroshell 120 EC-C18柱 （100 mmL×2.1 mm ID，2.7 μm）、Cortecs C18柱 （100 mmL×2.1 mm ID，2.7 μm）、Eclipse Plus C18柱 （100 mmL×2.1 mm ID，1.8 μm） 和 Accucore Vanquish C18柱 （100 mmL×2.1 mm ID，1.5 μm） 5種色譜柱。綜合各方面最終選取背壓較低、柱效較高的Poroshell 120 C18柱，實現了理想的試驗效果。

根據經驗和文獻資料，在正離子模式下于流動相中添加甲酸能增強目標化合物的離子化效率使靈敏度提高，試驗將甲醇、乙腈、甲酸銨溶液、甲酸溶液進行組合，從分離效果和靈敏度考查，選取最佳流動相體系。結果表明，水相中加入甲酸和甲酸銨都可以顯著提升靈敏度，提升效果基本一致，經試驗選擇添加0.1%甲酸能達到靈敏度和分離度的最佳效果。乙腈和甲醇相比具有更小的基線噪音和更強的反相洗脫能力，選擇乙腈為有機相能使梯度淋洗曲線的強度范圍更寬，同時在乙腈中加入相同的0.1%甲酸使保留時間更穩定。最終確定0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液作為流動相，出峰依次為曲吡那敏、地氯雷他定、氯苯那敏、溴苯那敏、阿司咪唑、苯海拉明、異丙嗪、奮乃靜、羥嗪、賽庚啶、西替利嗪、氯雷他定、氟奮乃靜、氯丙嗪、特非那定；豬肝陰性樣品空白色譜圖見圖2，可知該條件下無干擾。

15種藥物混合標準溶液的總離子流色譜圖見圖1，豬肝陰性樣品空白色譜圖見圖2。

圖1 15種藥物混合標準溶液的總離子流色譜圖

2.3 預處理方法的優化

畜禽肉中富含蛋白質、脂肪等，這些物質與目標化合物被提取液共萃出來，未經合適的凈化處理在離子源會與目標化合物爭奪電子，影響離子化，對目標化合物的電離效率造成抑制或放大，影響定量的準確性，因此削弱或抵消基質效應是液質分析的主要難點。多種鎮靜類藥物之間極性差異較大，為了兼顧特非那定等極性較弱化合物和曲吡那敏等極性較強的化合物的提取率，同時要盡可能地去除脂肪、蛋白質等干擾物，試驗考查了不同比例的乙酸乙酯-乙腈溶液作為提取溶劑時各化合物的提取效率，最終選擇乙酸乙酯∶乙腈（V∶V=20∶80）作為混合提取溶劑能達到滿意的效果。

圖2 豬肝陰性樣品空白色譜圖

試樣中被溶劑提取出來的目標化合物及其共萃物一般經過合適的SPE小柱能達到較好的富集和凈化效果，但是除了較高的成本之外，繁瑣的操作步驟不僅影響效率，而且會造成不穩定化合物的損失。試驗采用分散固相萃取凈化技術，常見的吸附劑有PSA，C18，GCB等，PSA主要吸附極性雜質，C18作為反相吸附劑適合用來去除脂肪，GCB主要吸附色素同時也會吸附具有平面結構的化合物。試驗采用的二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物具有親水親脂的平衡化學結構，能吸附去除極性范圍更大的干擾物。經比較試驗考查，1 g的用量能實現良好的除雜質需要，對于目標化合物無明顯吸附。

由于部分鎮靜類藥物具有相同的硫氮雜蒽母核，其環上硫原子所具有的2對孤對電子極易與基質中的金屬離子絡合甚至被儀器金屬管路吸附，造成重現性差、峰形拖尾等現象，EDTA能競爭絡合基質中的金屬離子使目標化合物被釋放出來，因此復溶時在初始比例流動相中加入EDTA（最終濃度為0.1 mol/L）較好解決這個問題。

2.4 基質效應的考查

液質分析中基質效應必然存在且無法完全消除，除了在預處理過程中實現最大效果的凈化，通常采用同位素內標法、標準加入法、基質配標法、稀釋法來削弱和校正基質效應造成的定量偏差；研究以基質效應明顯的豬肝為對象，通過優化梯度洗脫程序，采用基質配標法較好地解決了基質效應問題。

15種鎮靜類藥物的基質效應研究見表2。

2.5 方法學研究

2.5.1 線性與靈敏度

按照上述條件將1.4中制得的標準工作溶液經LC-MS/MS分析，以響應值為縱坐標（Y），以質量濃度（ng/mL） 為橫坐標（X） 繪制工作曲線，其回歸性系數R2均大于0.999，表明15種鎮靜類藥物在各自質量濃度范圍內線性良好。以定性子離子的3倍信噪比計算檢出限（LOD），10倍信噪比計算定量限（LOQ），可知15種鎮靜類藥物LOD為1.0～2.0 μg/kg，LOQ 為 2.0～6.0 μg/kg，靈敏度滿足實際檢測工作的需要。

表2 15種鎮靜類藥物的基質效應研究/ng·mL-1

15種藥物的線性范圍、線性方程、回歸性系數、檢出限和定量限見表3。

表3 15種藥物的線性范圍、線性方程、回歸性系數、檢出限和定量限

2.5.2 準確度與精密度

在雞肉、豬肝和牛肉基質中分別進行低、中、高3濃度水平6次回收率試驗。

15種藥物的準確度和精密度（n=6）見表4。

表4 15種藥物的準確度和精密度（n=6）

由表4可知，回收率為74.1%～88.2%，相對標準偏差（RSD）為2.9%～8.5%，該方法具有較好的準確度和精密度，能滿足實際檢測工作的需要。

2.5.3 實際應用

應用該方法對農貿市場與超市市售雞肉50份、牛肉50份、豬肝10份分別進行15種鎮靜類藥物的測定，檢出氯丙嗪陽性樣品2例，異丙嗪陽性樣品1例，奮乃靜陽性樣品1例，其余均未檢出。

3 結論

試驗建立了一個超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）同時測定畜禽肉中15種鎮靜類藥物殘留的技術體系。樣品經乙腈-乙酸乙酯混合溶液提取，提取液經二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物分散固相萃取凈化，反萃濃縮后用動態多反應監測方式測定含量。與目前報道的文獻與國家標準的方法相比，該方法擴大了同類型藥物檢測范圍，適應了更廣泛的基質，同時省去了復雜的前處理，能更快更好地為監管部門的執法提供技術支持，也為同類型的檢測技術研究提供了借鑒。