甲酸生物利用的研究進展

徐蓉，鄧王姝穎，姜衛紅，顧陽

1 中國科學院分子植物科學卓越創新中心 植物生理生態研究所 合成生物學重點實驗室，上海 200032

2 中國科學院大學，北京 100039

傳統工業微生物發酵主要以糖基類原料作為碳源，未來的發展趨勢是采用更為廉價的碳資源以提高生物制造路線的市場競爭力。一碳原料來源豐富、價格低廉，是良好的代糖原料。甲酸是主要的有機一碳化合物，也是重要的化工原料，來源廣泛，如二氧化碳 (CO2) 的電化學還原[1-2]、CO2的氫化[3-4]、生物質的選擇性氧化[5-6]、天然氣的部分氧化、天然氣和合成氣的水合作用等[7]?，F階段，工業上通常采用電解水[8]或水煤氣變換技術[9]將CO2和氫氣轉化為甲酸 (圖1)。近年來，受下游制造行業需求波動的影響，甲酸生產經常面臨產能過剩的問題，因此，亟待發展新的甲酸利用技術來實現產業鏈的拓展和延伸。

如上所述，在化工生產過程中，甲酸可由CO2直接還原獲得。同時，甲酸又是一種可被甲基營養菌利用的有機一碳化合物[10]。因此，構建以甲酸為發酵原料的微生物細胞工廠并用于合成各類化學品可有效聯結化工生產和生物制造兩大技術領域，從而有望解決甲酸產能過剩問題以及實現工業微生物發酵原料替代、降低制造成本的目標。

圖1 甲酸生產及生物利用 (甲酸可以通過 CO2電化學還原、CO2氫化、生物質的選擇性氧化、天然氣部分氧化等方式生產，進而由天然或人工生物轉化途徑實現利用)Fig. 1 Production and bioutilization of formic acid.Formic acid is produced by electrochemical reduction or hydrogenation of CO2, selective oxidation of biomass,and partial oxidation of natural gas; then, formic acid can be further utilized via natural or artificial biological processes.

1 天然甲酸同化途徑

甲酸的生物利用方式可主要歸結為兩類反應：1) 甲酸氧化為CO2，從而為微生物的生長提供還原力[11]。由于還原電勢較低[12]，甲酸是一種理想的電子供體。不足之處是，甲酸被氧化為CO2釋放后，其碳原子本質上并沒有被微生物同化吸收，造成代謝過程中的碳損失。2) 甲酸同化，即生物體內的甲酸與另一種代謝中間體縮合形成新的產物。該過程主要包含兩種反應方式：甲酸和四氫葉酸經甲酸-四氫葉酸連接酶(Formatetetrahydrofolate ligase，FTL)催化合成甲酰-四氫葉酸(10-formyl-THF)；或者甲酸和乙酰輔酶 A經丙酮酸-甲酸裂合酶 (Pyruvate formate-lyase，PFL)催化合成丙酮酸 (圖2)。

圖2 主要的甲酸同化反應 (FTL: 甲酸-四氫葉酸連接酶；PFL: 丙酮酸-甲酸裂合酶)Fig. 2 The major formate-assimilating reactions. FTL:formate tetrahydrofolate ligase; PFL: pyruvate formate-lyase.

PFL(EC 2.3.1.54) 是一類對氧敏感的丙酮酸-甲酸裂合酶蛋白家族的成員。通常情況下，在生物體內該酶能夠催化丙酮酸和輔酶A生成甲酸和乙酰輔酶A，并且該過程能夠產生ATP分子[13]。而這一反應的逆過程可實現甲酸同化。但需要指出的是，盡管研究者已經通過體外和體內實驗證明了 PFL可以催化上述逆反應過程[14-15]，但在生物體內該酶催化甲酸同化的效率較低[15]，有待進一步優化。因此，目前已知的生物體內的甲酸同化主要是基于 FTL催化的絲氨酸循環、還原性乙酰輔酶 A途徑以及還原性甘氨酸途徑實現。例如，甲基桿菌和產乙酸菌能夠分別通過絲氨酸循環和還原性乙酰輔酶 A途徑利用甲酸作為碳源生長。此外，基于 FTL的甲酸同化途徑以及催化后續反應的還原性甘氨酸途徑也被引入大腸桿菌中用于實現甲酸利用，但所構建的工程菌需補充除甲酸以外的其他有機碳源才能正常生長[16]。

1.1 絲氨酸循環

絲氨酸循環是一種 ATP消耗較多的甲酸代謝途徑。如圖3所示，甲酸通過多步催化反應首先生成活性中間體——甲基四氫葉酸(Methylene-THF)；甲基四氫葉酸將其一碳單元轉移至甘氨酸從而生成絲氨酸，并經后續多步催化被依次轉化為磷酸烯醇丙酮酸 (Phosphoenolpyruvate)、草酰乙酸 (Oxaloacetate)、蘋果酸 (Malate) 等重要中間體；蘋果酸則與輔酶A反應生成蘋果酰輔酶A，再進一步生成乙酰輔酶A。乙酰輔酶A作為中心代謝物可進入后續各類代謝途徑中，支持微生物生長及相關產物的合成。

許多甲基營養菌 (例如扭脫甲基桿菌Methylobacterium extorquensAM1) 可通過絲氨酸循環來代謝利用甲酸，具有潛在工業應用價值[17]。Kim等在大腸桿菌中構建了甲酸同化、絲氨酸合成以及轉化為磷酸甘油酸 (Phosphoglyceric acid)的人工途徑，并結合適應性進化的策略實現了工程菌利用甲酸合成乙醇的目標[18]。然而，絲氨酸循環與中心代謝有較多重疊 (草酰乙酸、蘋果酸都是重要的中心代謝物)，因而在對該代謝途徑進行人工設計和改造時需要更多地考慮如何減少對中心代謝途徑的擾動。此外，絲氨酸循環生成一分子乙酰輔酶A理論上需要消耗3分子NAD(P)H和 2分子 ATP[10]，還原力和 ATP消耗較多，因此不被認為是實現甲酸高效生物利用的首選路徑。因此，Liao研究組改造了天然的絲氨酸循環用于大腸桿菌的甲酸同化；他們通過引入絲氨酸脫水酶實現絲氨酸一步生成丙酮酸。相比于天然的絲氨酸循環，新途徑反應步驟較少，且消除了影響甲酸同化效率的潛在主要副反應[19]。

圖3 絲氨酸循環Fig. 3 Serine cycle.

1.2 還原性乙酰輔酶A途徑

還原性乙酰輔酶 A途徑 (通常又被稱為Wood-Ljungdahl途徑) 是一種反應步驟少、能量消耗低的甲酸同化代謝途徑 (圖 4)。該途徑代謝一分子甲酸理論上僅需要消耗1分子ATP、2分子NAD(P)H[10]。但由于途徑中的一些關鍵酶對氧敏感，因而主要存在于厭氧微生物中。如圖4所示，甲酸經由該途徑代謝時，首先與四氫葉酸(THF) 經FTL催化后生成10-甲酰-四氫葉酸，繼而經多步催化反應后生成 5-甲基-四氫葉酸(5-methyl-THF)。5-甲基-四氫葉酸的一碳單位與輔酶A以及CO基團在乙酰輔酶A合酶的催化下生成乙酰輔酶 A。在整個反應過程中，每生成1分子乙酰輔酶 A消耗4個甲酸分子 (1個被同化，3個提供NAD(P)H)[10]，原子經濟性要優于上述絲氨酸循環。

圖4 Wood-Ljungdahl途徑Fig. 4 Wood–Ljungdahl pathway.

目前，一些典型的產乙酸菌，如永達爾梭菌Clostridium ljungdahlii、伍氏醋酸桿菌Acetobacterium woodii等，已被報道可以通過還原乙酰輔酶A途徑以甲酸作為碳源進行生長和代謝[20]。但這些微生物的產物種類較為有限 (乙酸和乙醇為主)，并且與大腸桿菌和釀酒酵母等模式微生物相比，遺傳改造相對困難，因此限制了工程菌的開發進度，其甲酸利用效率距離實際工業應用尚有較大差距[21]。近年來，針對這些難改造微生物的分子遺傳操作技術取得了一定的進展[22]，使得人工設計和重構胞內還原性乙酰輔酶A途徑以及相關代謝網絡成為可能。作者所在的課題組近期也陸續建立了重要自養型產乙酸菌C. ljungdahlii的一系列新型分子遺傳操作技術[23-24]，實現了高效的基因組編輯，為后續優化該菌的甲酸代謝途徑以及合成目標產物提供了技術保證。

1.3 還原性甘氨酸途徑

還原性甘氨酸途徑在生物體內多種氨基酸和嘌呤代謝中發揮作用[25-26]。甲酸經由該途徑代謝時涉及的一個關鍵功能模塊是甘氨酸裂解系統(Glycine cleavage system，GCS)。甘氨酸裂解系統是生物體響應體內甘氨酸濃度變化并調節甘氨酸代謝平衡的主要模塊[27]，其催化的甘氨酸代謝是一個可逆的過程，即存在“裂解”和“合成”兩個方向。如圖 5所示，“裂解”反應是甘氨酸和絲氨酸分解代謝的主要途徑，形成的5,10-亞甲基四氫葉酸 (5,10-methylene-THF) 是生物體重要的一碳單位，也是核苷酸合成的重要原料；“合成”反應則與之相反，催化5,10-亞甲基四氫葉酸結合1分子CO2和NH3形成甘氨酸，繼而形成絲氨酸進入中心代謝途徑。顯然，沿“合成”反應方向運行，甲酸可被代謝并最終生成丙酮酸。與還原性乙酰輔酶A途徑不同，還原性甘氨酸途徑中沒有對氧敏感的酶，且大多數酶在生物體內普遍存在。此外，該代謝途徑與中心代謝途徑的重疊部分較少。因此，在生物體內引入或改造該途徑可有效減少對原有代謝網絡的干擾。

圖5 還原甘氨酸途徑Fig. 5 Reductive glycine pathway.

上述甘氨酸裂解系統已被證明在體外和體內均有催化甘氨酸生成的功能，也被認為是許多原核生物中甘氨酸的唯一來源[27]。但當研究者在大腸桿菌中重構還原性甘氨酸途徑以實現菌株代謝利用甲酸時發現，該途徑的引入不足以支持宿主菌以甲酸為唯一碳源進行生長，在發酵前期仍需添加少量的葡萄糖[28]。因此，目前看來，甲酸通過還原性甘氨酸途徑代謝的整個通路仍不暢通，加之能量供應不足，無法有效合成丙酮酸來支持宿主菌的生長，后續需要對還原性甘氨酸途徑以及胞內能量代謝體系進一步優化，消除或減少甲酸代謝時對其他有機碳源的依賴。在此方面，適應性進化是值得重點考慮的策略之一，并已經在優化大腸桿菌還原性甘氨酸途徑的反應效率中發揮效果[29]。

2 非天然甲酸同化途徑

如上所述，天然甲基營養菌的甲酸同化能力存在不足，加之遺傳改造較為困難，快速改變現狀的難度較大。作為替代方案，在一些易于遺傳改造的模式微生物中引入甲酸代謝途徑并實現甲酸高效利用是值得重點考慮的方向。

2.1 在微生物中構建異源天然甲酸同化途徑

還原性甘氨酸途徑廣泛存在于微生物體內，并且ATP消耗低，對氧不敏感，因此適合導入模式微生物中用于甲酸同化。Yishai等首次提出了在大腸桿菌中構建還原性甘氨酸途徑以實現工程菌利用甲酸作為碳源生長的策略[10]。之后，該研究組又通過整合來自扭脫甲基桿菌的甲基四氫葉酸連接酶、5,10-亞甲基-四氫葉酸-環化水解酶和5,10-亞甲基-THF脫氫酶以及過表達甘氨酸裂解系統的4種蛋白質 (H蛋白、T蛋白、P蛋白和L蛋白) 實現了甲酸代謝合成甘氨酸和絲氨酸；同時，研究者還引入甲酸脫氫酶 (FDH) 來優化胞內的還原力供給，以及敲除若干旁路的代謝酶，最終實現大腸桿菌工程菌共利用甲酸和CO2進行生長[30]。該研究組也在甘氨酸缺陷型的釀酒酵母中構建了還原性甘氨酸途徑，通過13C同位素示蹤實驗證明了該菌株生成的甘氨酸全部來自于甲酸，但并未實現甲酸的高效利用[31]。Lee研究組也嘗試在大腸桿菌中構建還原性甘氨酸途徑以實現大腸桿菌對甲酸的利用；他們通過引入M. extorquens的甲基四氫葉酸連接酶、5,10-亞甲基四氫葉酸-THF環化水解酶、5,10-亞甲基-THF脫氫酶和過量表達催化甘氨酸裂解反應的基因gcvTHP以及敲除該裂解反應的抑制基因gcvR，實現了細胞內甘氨酸的高效合成；最后，再通過引入了甲酸脫氫酶(FDH)優化胞內的還原力供給，實現大腸桿菌工程菌能夠利用甲酸和CO2維持基本生長[28]。

與還原性甘氨酸途徑類似，還原性乙酰輔酶A途徑 (Wood-Ljungdahl途徑) 是已知的反應步驟少、ATP消耗少的一種天然甲酸同化途徑。有研究者嘗試在丙酮丁醇梭菌中異源表達該途徑所有酶及輔因子，但發現其中的一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合酶復合物在丙酮丁醇梭菌中的活性很低，使得該途徑無法發揮作用[32]。因此，該途徑的異源表達目前仍然存在一些難點有待克服。

雖然甲酸同化途徑——還原性甘氨酸途徑已在大腸桿菌和釀酒酵母中構建成功并被證明可以發揮作用，但依然存在反應步驟多、能量需求大、甲酸利用率低等不足，造成需要額外補充其他碳源供菌體代謝利用。因此，設計全新的甲酸代謝途徑來克服上述缺陷是值得考慮的策略，同時也是一項具有挑戰性的工作。

2.2 設計新的甲酸同化途徑

2.2.1 甲酸-甲醛途徑

與甲酸相比，甲醛是一種高活性化合物，更容易作為前體物質被代謝途徑所吸收。甲酸轉化為甲醛有多種策略，一種是將甲酸一步還原成甲醛 (圖6)。Singh等[33]在多噬伯克霍爾德氏菌BurkholderiaMultivorans中發現了能夠高效催化甲酸還原成甲醛的甲醛脫氫酶 (BmFaldDH)，甲酸通過該酶可以催化生成甲醛。另一種策略是通過兩步反應催化甲酸還原為甲醛 (圖 6)。大腸桿菌或Pyrobaculum aerophilum來源的乙酰輔酶A合酶能夠催化甲酸與輔酶A結合生成甲酰輔酶A[34-35]。甲酰輔酶A則可以被乙?；囊胰┟摎涿复呋杉兹?。但是，天然的甲酰輔酶A合酶的反應速率較慢，可能成為催化過程的一個限速步驟[36-37]。當甲酸轉化為甲醛后，后續的甲醛代謝可考慮通過單磷酸核酮糖途徑(Ribulose monophosphate pathway，RuMP)來催化完成 (圖6)，從而徹底打通甲酸代謝途徑。

此外，甲醛對微生物的毒性也是構建這一新途徑時需要考慮的問題[38]。在發酵過程中采用低速流加甲酸的策略可以控制細胞內甲醛的合成量，從而部分地解決上述問題，但這可能會限制發酵強度。從菌株遺傳改造的角度考慮，如引入某些解毒機制[39]，來提高對甲醛的耐受能力是值得考慮的另一個方面。但解毒機制的引入也可能會造成甲醛的損耗，降低碳利用率，這就需要在設計改造策略時綜合平衡。

圖6 甲酸代謝途徑的人工設計 (左側：甲酸被還原為甲醛，進而催化生成乙酰輔酶A；右側：甲酸被催化形成甲酰輔酶A以進入代謝)Fig. 6 Artificial formate-assimilating pathways. Left: formic acid is reduced to formaldehyde and further converted to acetyl-CoA; Right: formic acid is converted to formyl-CoA.

研究人員已在大腸桿菌中利用RuMP實現了甲醛同化，即在阻斷木糖代謝中間產物5-磷酸核酮糖的下游代謝途徑的基礎上，同時引入單磷酸核酮糖途徑來催化胞內累積的5-磷酸核酮糖與外源添加的甲醛反應生成6-磷酸己酮糖(3-hexulose-6-phosphate)，并繼而進入中心代謝[40-41]。此外，江會鋒研究組基于化學合成原理，創建了一條從甲醛經3步反應合成乙酰輔酶A的新途徑(圖6)，即甲醛經乙醇醛合酶縮合成乙醇醛(Glycolaldehyde)，乙醇醛經乙酰磷酸合酶轉化為乙酰磷酸，最后乙酰磷酸通過磷酸乙酰轉移酶生成乙酰輔酶A[42]。這也是今后構建人工甲酸同化途徑時值得考慮的策略。

2.2.2 甲酸-甲酰輔酶A-絲氨酸途徑

構建新的甲酸同化途徑的另一個策略是將甲酸轉化為甲酰輔酶A，再構建基于甲酰輔酶A 的下游代謝途徑 (圖 6)。前期研究表明，甲酸可直接與輔酶A反應生成甲酰輔酶A[34-35]。由甲酸激活生成的甲酰輔酶A再與甘氨酸縮合生成氨丙酸半醛 (Aminomalonate semialdeyhde)[43-44]，之后氨丙酸半醛可以被多種酶(例如大腸桿菌的蘇氨酸脫氫)還原為絲氨酸。絲氨酸則可通過絲氨酸循環或絲氨酸-蘇氨酸循環生成重要中間體——乙酰輔酶A。

3 總結與展望

通過生物煉制將廉價碳資源轉化為高值化學品和燃料是未來綠色制造發展的重要方向。甲酸作為主要的有機一碳資源，來源廣泛，且可被微生物利用。大力發展甲酸生物利用技術，對于拓展現有甲酸下游產業鏈，提升市場競爭力具有重要意義。

自然界中存在一些天然甲酸利用微生物(表1)，但甲酸利用能力不足。目前，研究者對天然甲酸利用微生物的遺傳改造仍不同程度地存在技術瓶頸，效率較低。因此，在易于改造的模式微生物中引入和構建甲酸代謝途徑是值得考慮的重要方向。近年來，甲酸代謝途徑已被引入一些模式微生物中，并發揮了功能 (表1)。受限于宿主微生物原有的物質和能量代謝體系及調控網絡，這些改造的工程菌尚無法實現對甲酸的高效利用和轉化。進一步優化底盤細胞，并設計新的、反應步驟少、受宿主天然代謝及調控網絡影響小的甲酸代謝途徑是解決上述問題的關鍵。

綜上，目前關于微生物代謝利用甲酸這一有機一碳資源的研究較少，且缺乏對代謝途徑以及調控網絡的全面、深入了解，從而無法有效實施對菌株的代謝工程設計和改造。許多重要問題，如微生物的甲酸毒性耐受機制、甲酸代謝過程的物質和能量調控以及重塑策略等，都有待認識和解答。此外，分子技術平臺的進一步完善和優化對于甲酸生物利用的基礎性以及應用性研究均至關重要，這方面仍有極大的提升空間，值得我們去探究。

表1 可利用甲酸的天然和人工微生物Table 1 Natural and artificial microorganisms capable of using formic acid