洛利普蘭對棕櫚酸作用下SH-SY5Y細胞損傷的保護作用研究*

劉 冉，花亮亮，陳 娟，蔡 飛，李彩蓉**

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年人最常見的神經退行性疾病，其臨床特點主要表現為進行性的認知功能障礙[1]。AD的病因是多因素的，一般認為遺傳、環境和飲食因素之間的相互作用在AD的發病機制中起著一定的作用。大量的流行病學研究表明，富含飽和脂肪的飲食會增加患AD的風險[2]；大量實驗室研究也發現飽和脂肪酸飲食可增加血漿中飽和游離脂肪酸、棕櫚酸和硬脂酸的水平，導致嚙齒動物模型出現認知障礙以及學習和記憶缺陷。

SH-SY5Y細胞衍生于人的神經母細胞瘤細胞系，具有神經元的某些特性，可用于神經系統疾病的發病機制研究。棕櫚酸(palmitic acid，PA)可造成脂毒性損傷，是用來制作各種損傷模型的常見飽和脂肪酸之一。本實驗以SH-SY5Y細胞為研究對象，采用PA作為致病因子，研究磷酸二酯酶抑制劑洛利普蘭(rolipram，Rol)對PA作用下SH-SY5Y細胞的影響，并探究相關機制，為研究AD的發病機制和藥物防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞與相關試劑

SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞系(武漢華聯科技生物有限公司)；DMEM培養基(Hyclone公司)；胎牛血清 (FBS，Gibco公司)；青/鏈霉素(P/S，Hyclone公司)；0.25% EDTA 胰酶(Gibco公司)；Rol(Solarbio公司)；棕櫚酸(Solarbio公司)；Anti- Cleaved-Caspase3(Cell Signaling Technology)；Anti-GAPDH(Cell Signaling Technology)；MTT(大連美侖生物科技有限公司)；超氧化物陰離子熒光探針(DHE，碧云天公司)；DAPI(武漢科瑞有限公司)；其它為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

用含有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養基培養細胞，水平放置在37℃、5%CO2的細胞培養箱，待細胞生長至融合度80%～90%時，用0.25% EDTA 胰酶進行消化傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 實驗分組

給予0.2、2、20、100、200μmol/L的Rol作用細胞，培養24h，進行細胞存活率的檢測；給予不同濃度Rol(2.5、5、10、20μmol/L)進行預處理1h，然后給予 PA(150μmol/L)作用24h，檢測不同濃度Rol對PA作用下SH-SY5Y細胞存活率的影響；選取濃度10 μmol/L Rol觀察其對150μmol/L PA作用下SH-SY5Y細胞內ROS以及凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表達的影響。

1.3 MTT檢測細胞存活率

取出生長至融合度為80%～90%的細胞，將其傳代消化，并種于96孔板中，每孔中細胞數量約為8×103。種板結束后于培養箱中培養24 h，待孔板中細胞生長至融合度為70%～80%時，吸出原有培養基并加入不同濃度的Rol和PA作用于細胞。作用24 h后，避光操作，每孔加入預先配置好的MTT溶液20μL ，作用4h，避光操作。小心吸出孔內液體，每孔加入150μL DMSO，490nm吸光度檢測每孔OD值，計算細胞存活率。

1.4 DHE染色檢測細胞內ROS

在超凈臺中，將細胞爬片加入到24孔板中，待培養瓶中細胞長到80%～90%，開始種板，細胞數目約為5×104，注意種板時不要劇烈晃動。24 h后，孔板中細胞長到70%～80%后開始給藥，分別給藥24h后，PBS清洗3遍，洗去死細胞。避光配置DHE試劑溶液，每孔加250μL(覆蓋孔板即可)，培養箱放置30min。在培養箱取出，PBS清洗3遍，將配置好的DAPI試劑溶液均勻的滴加在爬片上15μL左右，作用10min。在培養箱取出，PBS清洗3遍， 取出爬片，放置在已經加好抗熒光萃取劑的載玻片上。將玻片放入熒光顯微鏡下觀察熒光強度及照相。

1.5 Western blot檢測凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表達

各組取30μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，用60V電泳30min后轉120V電泳1h左右；在300 mA下轉印160min后將膜放在5%脫脂奶粉中室溫封閉1.5h；加入適當用TBST按比例(1∶1000)稀釋的Antibody Cleaved-caspase3，并 4℃孵育過夜。一抗孵育過后，用TBST 洗滌3次后加入適當用TBST按比例(1∶5000)稀釋的二抗，孵育1h。二抗孵育過后，用TBST 洗滌3次后避光顯影。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 不同濃度Rol對SH-SY5Y細胞存活率的影響

給予0.2、2、20、100、200μmol/L 的Rol作用SH-SY5Y細胞24h，采用MTT檢測細胞存活率。結果發現0.2μmol/L和2μmol/L 的Rol對細胞存活率沒有明顯影響，20μmol/L、100μmol/L及200μmol/L 的Rol可降低細胞存活率(P<0.05)，見圖1。

與Con組比較，**P<0.05

2.2 不同濃度Rol對PA作用下SH-SY5Y細胞存活率的影響

給予不同濃度Rol(2.5、5、10、20μmol/L)進行預處理1h，然后給予 PA(150μmol/L)作用24h，采用MTT檢測細胞存活率。結果發現2.5μmol/L和5μmol/L 的Rol稍微增加PA作用下細胞存活率，但與PA組相比沒有統計學差異；10μmol/L與20μmol/L的Rol可增加PA作用下細胞存活率，與PA組相比有顯著性差異(P均<0.05)，結合前面不同濃度Rol對細胞存活率的影響，我們選擇10μmol/L的Rol進行后面的實驗，見圖2。

與Con組比較，**P<0.01；與PA組比較，##P<0.01

2.3 Rol對PA作用下SH-SY5Y細胞內ROS的影響

將圓形載玻片置于6孔板中，然后種入SH-SY5Y細胞進行培養。實驗分為正常(Con)組、PA組、PA+Rol組、Rol組。預先給予Rol，然后給予PA作用24h。實驗結束后給予熒光染色，觀察各組細胞內ROS的表達。結果發現PA處理后，細胞內的ROS熒光染色明顯增加，表現為粉紅色點狀變多；預先給予Rol預處理，可以減輕PA所導致的細胞內ROS表達，與PA組相比，有顯著性差異(P<0.01)；Rol組對細胞內ROS無明顯影響。見圖3(封二)。

2.4 Rol對PA作用下SH-SY5Y細胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的影響

將SH-SY5Y細胞在6孔板中進行培養，實驗分為正常(Con)組、PA組、PA+Rol組、Rol組。預先給予Rol，然后給予PA作用24h。實驗結束后提取總蛋白，用Western blot檢測凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的表達。結果發現PA可導致Cleaved-Caspase3蛋白表達升高，與Con相比有明顯差異(P<0.01)；預先給予Rol預處理，可以減輕PA所導致的凋亡蛋白表達，與PA組相比，有顯著性差異(P<0.01)；Rol組對Cleaved-Caspase3蛋白無明顯影響。見圖4(封二)。

3 討 論

隨著社會人口的老齡化，AD的發病率越來越高，飽和脂肪和富含棕櫚酸鹽的飲食會誘發AD和輕度認知障礙。AD的病理特征包括細胞內聚集的超磷酸化tau蛋白形成神經纖維纏結，細胞外聚集的淀粉樣蛋白形成老年斑，而BACE1 是淀粉樣蛋白形成的核心因素。大量的實驗研究表明，在許多AD嚙齒動物模型中，高脂肪飲食可增加BACE1活性和促進淀粉樣蛋白形成[3]。因此，利用PA制作脂毒性損傷模型可為體外研究AD的發病提供實驗模型。大量的研究表明，氧化應激及細胞凋亡在AD的發病機制中起著重要作用，進一步研究其發病機制和藥物防治是目前研究的熱點問題。

磷酸二酯酶抑制劑通過抑制磷酸二酯酶活性，增加細胞內cAMP的濃度，增加鈣離子內流，產生正性肌力的作用，在心衰、哮喘及勃起功能障礙等疾病中使用較為廣泛[4]。Rol是一種磷酸二酯酶4的抑制劑[5]，其對AD認知功能障礙的作用及作用機制尚未見報道。本研究以人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y為研究對象，采用PA制作脂毒性損傷模型，觀察Rol的防治作用。結果發現0.1～10 μmol/L Rol對細胞存活率無明顯影響，20～200μmol/L的Rol對細胞的損傷逐漸增大；MTT檢測顯示10μmol/L的Rol可增加150μmol/L PA作用下SH-SY5Y細胞存活率；研究發現PA可致SH-SY5Y細胞內ROS增加，導致Cleaved-caspase3蛋白表達上調，預先給予Rol可逆轉上述改變。以上結果提示Rol對PA所致細胞脂毒性損傷具有保護作用，其保護機制可能與抑制細胞內氧化應激及細胞凋亡有關，該研究可為Rol用于AD的防治提供實驗和理論依據。