柱切換-液相色譜法測定嬰兒配方奶粉中4種雌激素

俞華芬

(余杭區農產品質量安全檢驗檢測站，杭州311100)

雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚是結構相近的人工合成雌激素，均含有酚羥基，為弱酸性化合物。由于其致癌作用[1]，歐盟(96/23/EC)已禁止使用，美國和加拿大則限量使用，我國農業部在2002年第193號公告里明令禁止性激素和具有雌激素作用的物質在食品動物中的使用。國家食品安全風險監測計劃每年均將雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚等列為監測對象，尤其是嬰兒配方奶粉中的雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚更是監測的重點對象。

目前乳制品中雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚等4種雌激素的測定方法主要有高效液相色譜法[2-3]和液相色譜-串聯質譜法[4]。高效液相色譜法雖容易普及，但靈敏度低，且需要較為苛刻的條件才可使4種物質完全分離，達到準確定量的要求；液相色譜-串聯質譜法因具有極高的選擇性和靈敏度，可不要求高分離度亦可準確定量，但該設備較為昂貴，普及率不及高效液相色譜法，且往往需要固相萃取及同位素內標，測定成本極高。

柱切換-液相色譜法[5]是近幾年興起的應用于復雜基質的測定方法，其主要特點是在線凈化、濃縮，在獲得較為理想的凈化效果和靈敏度的同時，簡化了樣品的前處理步驟，達到降低測定成本及減少人為誤差的目的。文獻[6]應用二維液相色譜法建立了配方奶粉中維生素B12的測定方法，該方法相比于傳統的免疫親和柱固相萃取-液相色譜法，測定周期縮短了40 min，測定成本降低了85%。本工作針對配方奶粉中的雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚等4種雌激素建立了柱切換-液相色譜法，在獲得極高靈敏度的同時，大大降低了測定成本，可適用于一般實驗室的日常風險監測。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Dionex UltiMate 3000 型高效液相色譜儀，配六通閥、大體積自動進樣器、紫外檢測器；Beckman Coulter Allegra 64R 型高速離心機；Millipore Integral 3 型 超 純 水 裝 置；N-EVAP 112 型 氮 氣 吹干儀。

4種雌激素標準儲備溶液:100.0 mg·L－1，分別稱取10.0 mg的雌二醇標準品、己烷雌酚標準品、己烯雌酚標準品、己二烯雌酚標準品，用適量的甲醇溶解并定容至100.0 m L。

4種雌激素混合標準溶液系列:分別移取適量的4種雌激素標準儲備溶液，用甲醇稀釋配制成1.0，2.5，5.0，10，20 μg·L－1的 混 合 標 準 溶 液系列。

雌二醇標準品、己烷雌酚標準品、己烯雌酚標準品、己二烯雌酚標準品的純度依次為99.0%，98.5%，99.0%，99.5%。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸均為色譜純，試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Thermo BioBasic SEC-120凈化柱(300 mm×7.8 mm，5μm)，Waters XBridge BEH C18分析柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)；樣品室溫度15 ℃，柱溫45 ℃；流量0.8 m L·min－1；進樣量1.0 m L；測定波長280 nm。流動相:A 為水，B 為甲醇。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

柱切換模式見圖1。

圖1中閥位置為1～2時，試驗進行系統平衡、分析，即開啟凈化模式；當閥位置切換為1～6時，試驗進行目標物洗脫及收集，即開啟分析模式。切換時間為0 min 時，閥位置為1～2；切換時間為15.0 min時，閥位置為1～6；切換時間為16.5 min時，閥位置為1～2。

1.3 試驗方法

稱取嬰兒配方奶粉樣品約5.0 g于50 m L帶蓋離心管中，加入10 m L 水超聲溶解后，加入20 m L乙腈，混勻后超聲提取30 min，以15 000 r·min－1轉速在5 ℃下離心10 min，轉移上清液于另一離心管中。殘渣用10 m L乙酸乙酯提取，合并兩次提取液，充分振蕩后靜置，待分層。轉移上層有機相，棄去下層水相，有機相于40 ℃下用氮氣吹至近干，加入2 m L的50%(體積分數)甲醇溶液溶解，溶解液過0.22μm 濾膜，按儀器工作條件進行測定。

圖1 柱切換模式Fig.1 Column switching mode

2 結果與討論

2.1 色譜行為

4種雌激素混合標準溶液的色譜圖見圖2。

圖2 4種雌激素混合標準溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution of 4 estrogens

2.2 分析柱的選擇

文獻[3]用Nova-Pak C18色譜柱(150 mm×3.9 mm，4μm)使原本較難分離的己烷雌酚、己烯雌酚和己二烯雌酚得到了較好的分離，但其使用的流動相p H 為3.5，色譜柱柱溫為55 ℃，為色譜柱耐受的極限條件，不利于色譜柱的使用壽命。文獻[7]使用Xterra C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)獲得了4種雌激素的分離，所使用的流動相為磷酸鹽緩沖溶液，該流動相穩定時間較長，且極易造成色譜柱及管路系統的腐蝕、堵塞，實用性受限?？紤]到此類問題后，試驗嘗試僅用水和甲醇作為流動相，對3種不同規格的分析柱進行比較，結果見圖3。

圖3 使用不同分析柱時4種雌激素的色譜圖Fig.3 Chromatograms of 4 estrogens with different analytical columns

由圖3 可知:Dionex Acclaim120 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)的分離度較差，無法將4種目標化合物進行分離；Waters XBridge C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)較 之Dionex Acclaim120 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)有顯著提高，但己烷雌酚和己烯雌酚未能達到完全分離，影響準確定量；Waters XBridge BEH C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)的分離度最佳，4種目標化合物均得到完全分離，完全滿足準確定量的要求。原因主要為Waters XBridge BEH C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)的填料顆粒直徑為2.5μm，相比于其他色譜柱的5μm 填料具有更好的柱效，且填料使用了核殼技術，在相同的流量下具有更低的柱壓。試驗選擇Waters XBridge BEH C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)作為分析柱(即第二根色譜柱)。

2.3 凈化柱的選擇

凈化柱(即第一根色譜柱)是用于樣品的凈化與富集，并與第二根色譜柱配合使用，也就要求其既具有高通量又要能與第二根色譜柱兼容。試驗采用兩根流動相體系可與反相C18兼容的凈化柱進行試驗，結果見圖4。

由圖4可知:雖然兩者對目標物均有較好的保留，但 Thermo BioBasic SEC-120 色 譜 柱(300 mm×7.8 mm，5μm)的效果較好，不僅將目標物與部分雜質分離，且峰形較為對稱，峰寬較窄，有利于后續操作；Agilent ZORBAX GF-250 色譜柱(250 mm×9.4 mm，4μm)的凈化效果不明顯，雜質與目標物基本共流出。因此，試驗選擇Thermo BioBasic SEC-120 色 譜 柱(300 mm×7.8 mm，5μm)為凈化柱，目標峰的截取時間為15.0～16.5 min。

2.4 提取溶劑的選擇

雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚和己二烯雌酚是強親脂性物質，在甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑中的溶解度較高。試驗針對的是配方奶粉基質，富含蛋白質和脂肪，因此首選的提取溶劑為乙腈，其具有極佳的蛋白沉淀效果[8-9]。試驗分別比較了乙腈提取1次、乙腈提取2次以及先乙腈提取，再乙酸乙酯提取對4種雌激素提取效率的影響，結果見圖5。

由圖5 可知:僅用乙腈提取1 次，提取效率僅50%左右，進行2次提取后，提取效率明顯提高；先乙腈提取，再乙酸乙酯提取的效果要優于兩次均用乙腈提取的效果。兩次乙腈提取的提取效率略低的原因可能是乙腈提取后需用鹽析使有機相與水相分離，有極少目標物被包裹或吸附在固體鹽中。乙酸乙酯與水不互溶，將兩次提取液合并靜置數分鐘后，無需鹽析水相與有機相即可分離，因此可獲得較好的提取效率。試驗選擇先乙腈提取，再乙酸乙酯提取。

圖4 使用不同凈化柱時4種雌激素的色譜圖Fig.4 Chromatograms of 4 estrogens with different purification columns

圖5 提取溶劑對4種雌激素提取效率的影響Fig.5 Effect of extraction solvent on extraction efficiency of 4 estrogens

2.5 標準曲線和檢出限

按儀器工作條件對1.0，2.5，5.0，10，20μg·L－1的4種雌激素混合標準溶液系列進行測定，并繪制標準曲線。結果表明:4種雌激素的質量濃度均在1.0～20μg·L－1內與其對應的峰面積呈線性關系，線性回歸方程和相關系數見表2。

以3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)，以10倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N)，結果見表2。

表2 線性回歸方程、相關系數、檢出限和測定下限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.6 精密度和回收試驗

按試驗方法對空白配方奶粉樣品進行加標回收試驗，每天平行測定6次，重復測定11 d，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結果見表3。

由表3 可 知:回收率為90.0% ～105%，日內RSD為1.6%～5.4%，日 間RSD 為3.5%～6.2%。

表3 精密度和回收試驗結果Tab.3 Results of tests for precision and recovery

2.7 方法比較

使用本方法及國家標準方法GB/T 22992－2008對同一加標的空白配方奶粉樣品(加標量0.5μg·kg－1)進行分析，結果見表4。

表4 本方法與國家標準方法的比較(n＝5)Tab.4 Comparison between the method and the GB method(n＝5)

由表4 可知:本方法相比于GB/T 22992－2008，時間可節省30%，費用節省80%。本方法準確度、精密度與液相色譜-串聯質譜法相當[10-11]。

本工作先用乙腈沉淀配方奶粉中的蛋白，再用乙酸乙酯提取、濃縮提取液，然后采用凝膠柱凈化、濃縮，反相C18分析柱分離，紫外檢測器測定，方法的靈敏度與穩定性得到了大大的提高，而樣品的測定周期及測定成本卻顯著降低，非常適用于配方奶粉中雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚和己二烯雌酚等4種雌激素的測定。