藥對丹參-當歸作用阿爾茨海默病的網絡藥理學機制研究

郭小嵐， 李 迪， 汪先花， 顏學玲， 熊 航， 時 政

(成都大學四川抗菌素工業研究所&醫學院， 成都 610106)

1 引 言

藥對，作為臨床中醫遣藥組方常見的配伍形式,組成精煉但基本具備中藥配伍的特征,臨床應用行之有效，按照一定的理論依據和組合原則，將2味相對固定藥物的配伍組合，以發揮協同增效或配伍減毒等的作用[1-2].丹參，雙子葉植物唇形科.其藥理作用、臨床應用廣泛，歸納得出，在治療心血管疾病、消化系統疾病、神經系統疾病及抗菌、清除炎癥方面具有重要療效[3].當歸，傘形科植物，其主要化學成分對機體的造血系統、循環系統、神經系統、免疫系統等多個系統具有顯著的藥理作用[4].丹參重在活血化瘀，當歸作用補益略偏補血[5]，中藥按照“君臣佐使”的原則配伍一組藥，可達到增效減毒的作用[6-7]，藥對丹參-當歸在神經系統方面都有良好的臨床作用，配伍后體外抗氧化能力優于單味藥材[8]，既補益又活血化瘀.眾多發現，丹參和當歸作為單味藥材作用阿爾茨海默病的機制有了一定進展，但目前對于藥對丹參-當歸多成分、多靶點、多代謝途徑作用阿爾茨海默病的機制尚需進一步明確.

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是特征為進行性認知功能障礙和行為損害的中樞神經系統退行性病變，臨床表現為記憶障礙、失語、失用和失認，以及視空間機能障礙、人格行為改變和執行功能障礙等.現治療阿爾茨海默病的常用臨床藥物有多奈哌齊、加蘭他敏、利斯的明、他克林等，但其毒副作用較強.目前發現，眾多中藥有效成分(如黃酮類、苷類、生物堿類等)對AD有較好的治療作用且毒副作用弱[9].在AD的發病機制方面存在著很多假說，包括如下：①金屬離子的代謝紊亂和信號通路的改變；②腦供血和營養的不足；③淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、早老素基因(presenilin，PSEN)的突變和載脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)等位基因的突變；④線粒體紊亂；⑤神經生長因子的缺乏；⑥Aβ毒性假說；⑦Tau假說等[10].雖有眾多假說，但關于AD的發病機制目前尚未完全明確.現目前，主要研究乙酰膽堿酯抑制劑和N-甲基-D天門冬氨酸受體阻滯劑干預阿爾茨海默病，但其并不能逆轉疾病過程，且存在副作用較多.因此，對其治療仍然存在很多問題.單一靶點治療疾病臨床效果欠佳，而中藥具有多成分、多靶點、調節方式多樣的特點，其次相對比西醫單靶標、單成分的傳統研究思路來研究中藥，難以體現中藥的系統性[11].因此我們可以利用一個分析平臺，系統地研究中藥作用某一疾病的機制，進行探討研究.現目前網絡藥理學在我國已經被廣泛應用，包括數據收集、靶點預測、網絡分析與可視化、多組分相互作用和信號通路預測等[12].其主要思想與傳統中醫藥的整體觀相互補，系統而透徹的分析了中藥治病的作用機制.本文采用此想法，對藥對丹參-當歸作用阿爾茨海默病的機制進行探討研究.

本文采用類藥性(drug-likeness，DL)評估，DL≥0.18，口服利用度(oralbioavailability，OB)≥30%作為篩選標準，然后通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)尋找與候選化合物相關的潛在靶點，進而在數據庫中查閱相關文獻收集阿爾茨海默病相關靶點，人工檢索候選化合物的潛在靶點是否與阿爾茨海默病相關，最后利用Cytoscape3.5.1軟件構建候選化合物-靶點網絡、靶點-通路網絡以及化合物-靶點-通路網絡，為藥對丹參-當歸作用阿爾茨海默病的網絡藥理學機制提供理論依據.

2 材料與方法

2.1 材 料

化學成分的篩選利用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)(http：//lsp.nwsua.edu.cn/tcmsp.php)得到丹參、當歸兩味中藥相關的所有化學成分，其中丹參有202個活性成分，當歸有125個活性成分.目標活性成分的篩選標準主要依據TCMSP數據庫中的建議藥物篩選標準：類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18、口服利用度(Oralbioavailability，OB)≥30%等.

2.2 方 法

2.2.1 化學成分靶點預測和阿爾茨海默病靶點的收集 通過TCMSP平臺尋找丹參、當歸18個化學成分的相關潛在靶點.根據TCMSP平臺所提供的阿爾茨海默病潛在靶點，以及對大量有關阿爾茨海默病發病機制文獻的調研，人工檢索剔除無關靶點，作用于阿爾茨海默病發病機制的相關靶點在Uniprot數據庫將靶蛋白校正為官方名稱，潛在靶蛋白信息見表3.

2.2.2 作用網絡分析 將上一步驟獲取的靶點蛋白信息通過注釋、可視化和整合發現的數據庫(database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID)數據庫進行GO(Gene Ontology)及KEGG通路注釋.候選化合物-靶點網絡、靶點-通路網絡以及化合物-靶點-通路網絡的構建均使用Cytoscape軟件.

3 結 果

3.1 化學成分的篩選

通過條件篩選，選取了丹參的16個化學成分，當歸的2個化學成分，共有18個化學成分，當歸的主要活性成分是β-谷甾醇，豆甾醇，見表1；丹參的主要有丹參酮Ⅱ、丹參新酮、隱丹參酮等，見表2.

表1 當歸活性成分及類藥性值

Tab.1 The active components and medical value of Angelicasinensis.

編號Mol IDMolecule NameMWOB/%DLM01MOL000358beta-sitosterol414.7936.910.75MO2MOL000449Stigmasterol412.7743.830.76

表2 丹參活性成分及類藥性值

表3 藥對丹參-當歸活性成分作用潛在靶蛋白的信息

3.2 化學成分靶點預測和阿爾茨海默病潛在靶點

丹參、當歸18個化學成分通過TCMSP分析平臺找到430個靶點.篩選出丹參當歸中與阿爾茨海默病相一致的靶點18個，將這18個靶點投入到Uniprot數據庫，得到所有靶點對應編號.

3.3 作用網絡分析

綜合以上得到的數據，用軟件Cytoscape3.5.1構建候選化合物-靶點網絡，見圖1；靶點-通路網絡，見圖2；使用Merge功能將其合并成為化學物-靶點-通路圖，見圖3；結合KEGG數據庫進行通路分析.

圖1 化合物-靶點作用網絡圖

內圈橢圓形表示的是藥對中的活性成分，外圈四邊形表示靶點.

預測藥對丹參-當歸中具有潛在作用阿爾茨海默病活性成分的化合物-靶點作用網絡圖如圖1.當歸中的主要作用成分為β-谷甾醇，豆甾醇，丹參的主要有丹參酮Ⅱ、丹參新酮、隱丹參酮、二氫丹參酮等.這些化學成分當中含有BCL2、NOS2、PTGS2、CHRM1、CHRM2、CHRNA7、HTA2、HTA3等18個靶點作用于阿爾茨海默病.分析發現得，甾醇、丹參酮作為潛在化學成分在抗阿爾茨海默病作用中發揮著重要作用.

圖2 靶點-通路網絡圖

靶點-通路圖可見圖2，GSK-3β參與Wnt信號通路、細胞周期、磷酸化途徑、海馬發育等通路；CHRM1、CHRM2、NOS2參與鈣離子信號途徑，神經受體-配體相互作用；CHRM1、CHRM2作用肌動蛋白骨架調節；還有作用于膽堿能突觸的ACHE、CHRNA7、CHRM2；顯示了不同通路之間也有共同作用的靶點，結果映射了藥對丹參-當歸作用阿爾茨海默病多個靶點、多個代謝途徑共同協調的特點.

從圖3中可以看到，藥對丹參-當歸中的CHRNA7,CHRM1,PTGS2,ACHE,APP,GSK-3β,HTR2A，NOS2為高緯度節點，這些節點在AD治療過程中扮演者重要的角色.GO生物學通路及KEGG代謝通路富集分析，藥對丹參-當歸的活性成分主要作用通路為鈣信號通路、Wnt信號通路、神經受體-配體相互作用、海馬發育、膽堿能突觸、血清能突觸、磷酸化調控等.說明藥對丹參-當歸通過多成分、多靶點、多種調節方式作用阿爾茨海默病.

圖3 化合物-靶點-通路圖

其中外圈六邊形表示參與的通路，中圈四邊形表示作用的靶點，內圈橢圓形表示藥對的活性成分

4 討 論

目前，乙酰膽堿酯酶是AD治療的重要靶點.已知美國FDA批準的5個AD治療藥物，其中有4個為AChE抑制劑.它們主要通過抑制AChE催化位點，以減少突觸間隙乙酰膽堿的降解，從而進一步提高ACh水平，促進膽堿能神經傳遞功能，進而改善患者的認知和記憶功能[13].治療AD經典的靶蛋白膽堿酯酶(CHE)主要有兩類：一為乙酰膽堿酯酶(ACHE)，主要作用水解神經遞質乙酰膽堿(ACH)；二為BCHE.因此存在一種假說：應采用針對ACHE以及BCHE的膽堿酯酶抑制劑以治療阿爾茨海默病.

M1受體激動劑(CHRM1)，其通過干預β淀粉樣蛋白的生長，產生神經生長因子樣作用，減弱CHRM1產生的神經毒性和tau蛋白的過度磷酸化，以及縮短后超極化的時間等途徑來保護神經元細胞[14].M1受體還可以通過與BACE1的直接相互作用,作用BACE1蛋白，降低Aβ的形成，再經過蛋白酶體-泛素通路的降解,進一步抑制Aβ的生成和累積，減少具有神經毒性的淀粉樣斑沉積[15].CHRM1通過調節淀粉樣β前體蛋白APP的代謝，以及作用于tau蛋白，減少過度磷酸化，有助于延緩AD的病情的發展，提高患者學習記憶能力[16].

GSK-3β是GSK-3的一種亞型，GSK-3作為主要的tau激酶，在AD病程發展中的記憶障礙、小膠質細胞介導的炎癥、tau蛋白磷酸化、炎性因子的釋放以及突觸丟失和神經元死亡等方面，從多途徑發揮抗AD的作用[15,17].APP代謝異常和tau蛋白異常磷酸化過度是影響阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)發展的重要因素.GSK-3β在參與淀粉樣蛋白質前體(amyloid precursor protein,APP)代謝的前提下，還作用于tau蛋白過度磷酸化過程，GSK-3β的表達與活性的異常是導致神經元細胞凋亡的常見原因[18-19].故GSK-3β與AD的病理變化有密切的聯系.APP具有抗Aβ神經毒性作用，阻止腦組織神經元數目的減少、斑塊沉積與神經元凋亡.

KEGG代謝通路富集分析結果見圖3，主要作用通路為MAPK激酶途徑，鈣離子信號途徑、肌動蛋白細胞骨架的調節、神經性的配體-受體相互作用Wnt信號通路、細胞周期、細胞凋亡調控、磷酸化途徑等[20]，這代表藥對丹參-當歸中的活性成分作用于多個靶點及多條代謝通路來干預AD的發生發展.在MAPK激酶途徑中，MAPK信號轉導刺激引起細胞產生相應反應進而調節細胞分化、增殖、凋亡，來保護神經元組織細胞[21].

從靶點-通路網絡作用圖中看出APP,GAK-3β對海馬發育、細胞周期有一定的調節作用，而CHRM1.CHRM1,GABRA5,NOS2在神經性的配體-受體相互作用上發揮著重要作用；Wnt信號通路和鈣離子信號途徑，減輕炎癥反應，加大細胞存活率，中樞神經系統受到損傷后機體會啟動Wnt信號通路,進而促進中樞神經系統的再生修復[22-23]，在某種程度上對阿爾茨海默病有著治療作用.

中藥成分多樣，多靶點多通路協同作用，通過以上數據顯示：藥對丹參-當歸作用于鈣信號通路、Wnt信號通路、神經受體-配體相互作用、海馬發育、膽堿能突觸、血清能突觸、磷酸化調控等代謝通路，其可以調節細胞的周期、抗凋亡、抗炎、抗氧化及保護神經元細胞和抑制膽堿酯酶活性，增強突觸形態改善學習記憶障礙從而發揮改善學習記憶的能力，發揮抗阿爾茨海默病作用，但本研究預測的藥對丹參-當歸潛在化學成分及其靶點蛋白需要進一步的實驗驗證.