基于18S rDNA、rbcL和atpB序列的輪藻科植物的系統發育研究

任玲萱， 方 琰， 孫 雙， 白 歡， 卿人韋， 蘭利瓊

(1.四川大學生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室， 成都 610065;(2.國網四川省電力公司電力科學研究院，成都 610065)

1 引 言

輪藻植物(Charophyte)是一種大型的淡水藻類，其外觀形態復雜，有類似“根、莖、葉”的分化.輪藻的營養體由假根(rhizoid)、莖(stem)、小枝(branchlet)構成，而莖主要由節(node)、節間(internode)、皮層(cortex)、托葉(stipulode)構成.輪藻的生殖器官為藏精器(antheridium)和藏卵器(oogonium)，藏卵器頂端有5個排成一層或是10個排成兩層的冠細胞(coronular cell)[1-5].上述形態均是傳統輪藻植物分類的重要依據.

輪藻門(Charophyta)僅有一綱一目一科，即輪藻綱(Charophyceae)，輪藻目(Charales)，輪藻科(Characeae).輪藻科分為麗藻族(Nitelleae)和輪藻族(Chareae)，其中前者的莖與小枝無皮層，冠細胞10個排列成2層；后者的莖與小枝有或無皮層，冠細胞5個排列成1層.又根據部分位置的細微結構，將麗藻族分為麗藻屬(Nitella)和鳥巢藻屬(Tolypella)；將輪藻族分為擬麗藻屬(Nitellopsis)、麗枝藻屬(Lamprothamnium)、燈枝藻屬(Lychnothamnus)和輪藻屬(Chara)[1-5].輪藻科分類的研究雖是藻類中開始較早的一個類群，但因其形態結構、生殖方式比較特殊，以至于在植物分類系統中的位置以及其內部的系統分類至今還存在爭論.除此之外，輪藻在水生植物向陸地植物演化的過程中也扮演著重要的角色[6]，因此進一步闡述輪藻植物內部系統發育對闡釋整個植物界的起源與演化歷程意義重大.在傳統的形態學分類研究中，常根據托葉，皮層，冠細胞和小枝的形態進行分類，但是在其亞屬(subgenus)和組(section)的分類上，分類群之間有形態特征交叉重復，界線不分[2-3].因此找到合適的基因片段對輪藻物種進行鑒別，可提高物種鑒定的成功率，了解輪藻植物多樣性，同時有助于進一步探討其在植物進化過程中的地位.早在1996年Mccourt等利用rbcL基因對輪藻植物與其他植物的系統發育關系進行了研究[7].近年來，國際輪藻學者也將分子系統手段運用于輪藻植物物種再鑒定的研究中，Kato等利用rbcL序列進行分子系統發育研究，進一步驗證了C. altaica的分類地位[8].Casanova從新修訂了澳大利亞地區Chara-Charopsis亞屬中部分輪藻藻種的分類地位，為澳大利亞今后的輪藻研究奠定了基礎[9].

我國曾是輪藻資源大國[10]，但對輪藻的研究較為薄弱，有長時間的研究空白階段，僅有關于輪藻化石，輪藻與環境污染以及輪藻功能性的研究[11-14]，在輪藻科植物的分類方面無詳細報道.與此同時，因輪藻對生境水體的清潔度要求較高，對水質變化較為敏感[15-16]，且由于近年來人類活動范圍的擴大，環境污染問題日益嚴重，輪藻棲息地消減，使得輪藻植物正在逐年減少，變得稀有罕見，甚至瀕臨滅絕，很多國家將其列入瀕危物種名錄[17]，同時也側面說明了當今對輪藻植物研究的重要性.

本研究對中國西南地區輪藻科5個屬，8種輪藻進行18S rDNA，rbcL及atpB基因擴增，并結合GenBank中其他地區輪藻的已知序列，針對中國輪藻植物的系統發育展開研究，并進一步討論其內部分類結構.

2 材料與方法

2.1 材 料

本研究共收集到8種輪藻的12株樣本，其中含輪藻族4個種，麗藻族2個種，根據《中國淡水藻志》鑒定.同時結合GenBank數據庫中已知輪藻序列，共有12種輪藻的24株樣本用于本研究的系統發育分析中，具體樣本信息見表1.

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品DNA提取、PCR擴增及測序 稱取新鮮藻株前5節，稱取0.5 g(濕重)，經液氮充分研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech(Beijing)Co.，Ltd，Beijing，PA，China)提取全基因組DNA.以樣本DNA為模板，對18S rDNA、rbcL及atpB基因進行引物設計并擴增，使用引物分別為：18S p1 (5′-GCCGAAAGACT-AAGCCATGC-3′)，18S p2 (5′-CAGACACTTC ACCGGACCATT-3′)，Tm=57.5 ℃；rbcL p1：(5′-TCGTGTAACTCCACAACCTG-3′)，rbcL p2：(5′-TACTCGGTTAGCTACAGCTC-3′)，Tm=55.4 ℃；atpB p1(5′-GCGGTCGTATTTTCAATGT ATTAGGAG-3′)，atpB p2：(5′-CGCTTCTTCAGATAATTCGTCTAAACC-3′),Tm=58.2 ℃.PCR體系參照PCR反應試劑(Vazyme(Nanjing)Co.)，反應條件參照文獻[18-19].PCR產物進行TA克隆并送至擎科公司進行測序.

2.2.2 數據處理 將測序獲得的序列采用相似性搜索法(BLAST)檢查根據傳統分類學鑒定方法鑒定的成功率，將鑒定正確的序列上傳至GenBank.結合GenBank數據庫相關序列，使用MEGA 7.0中的ClustaW軟件進行多序列對比，計算和分析種內及種間的K2P(Kimura 2-parameter)遺傳距離、總平均遺傳距離，并分析保守位點(conserved site)、變異位點(variable site)，信息位點(informative site)以及GC%[20].使用MEGA 7.0，基于18S rDNA，rbcL，atpB及18S rDNA-rbcL-atpB(3-loci)序列構建ML、NJ系統進化樹[18]，對系統發育樹的拓撲結構的可靠性通過自展法(bootstrap, BS)進行1 000次的重復取樣.使用MrBayes 3.2.5構建BI樹，通過馬爾科夫鏈(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)隨機選取進化樹，以四條鏈(nchains=4)共運行2 000 000代，每隔1 000代保存一棵樹，所得進化樹的前25%被舍棄(burn-in)[21].進化樹所得支持率(ML/BI/NJ)≥50%的分枝可信度較高[22]，“*”表示BS值為100，“-”表示進化樹拓撲結構為平行支.以上系統進化樹中均已Chaetosphaeridium pringsheimii(KU130815、KJ395939、KJ395821)，Chlorella sorokiniana(KP726221、KT777994、EF113498)和Chlorella vulgaris(KX495055、AB260909、D10997)作為外類群(outgroup)[23].

3 結果與分析

3.1 18S rDNA，rbcL及atpB序列多樣性分析

18S rDNA，rbcL及atpB序列多樣性分析結果如表2所示，18S rDNA基因的保守位點比例最高，變異位點及簡約信息位點比例最小，同時GC%最高，以上均表明18S rDNA序列較為保守.且18S rDNA序列的種間遺傳距離與種內遺傳距離重疊，差異較小，計算得T.intricata與T.prolifera的種間距離為0.rbcL與atpB基因的分析結果相似，兩者序列變異度高于18S rDNA，信息位點較多.但atpB序列種間與種內遺傳距離重疊，計算得C.connivens與C.globularis的種間遺傳距離為0.001.rbcL及三基因聯合序列種間遺傳距離與種內遺傳距離無重疊，有一定差異.

表2 18S rDNA，rbcL及atpB序列多樣性分析結果

3.2 分子進化樹分析

3.2.1 基于18S rDNA基因的輪藻科植物系統發育研究 基于18S rDNA基因分析所得的進化樹樹主要分成了兩個分支(圖1)，第Ⅰ分支由輪藻族(Chareae)植株構成，第Ⅱ分支由麗藻族(Nitelleae)植物構成，輪藻族與麗藻族分別形成單系群，這與傳統形態學分類所得輪藻科植物的分類結構一致[2-4].

在第Ⅰ分支中，輪藻屬植物聚類到一支，形成單系群；燈枝藻屬與擬麗藻屬親緣關系較近，成為輪藻屬植物的姐妹群.輪藻屬內Chara-Grovesia分支的分類結構發生混亂，其中C.connivens與C.globularis平行交錯，無法分開.Chara-Chara分支的四個樣本以較高的支持率聚類到一支，與其他藻種分開.在第Ⅱ分支中，麗藻族被分為麗藻屬和鳥巢藻屬兩個分支，傳統形態學分類也將麗藻族劃分為兩個屬，分子進化樹的拓撲結構支持形態學分類[2-4].鳥巢藻屬內部Tolypella-Rothia與Tolypella-Tolypella以很高的支持率將鳥巢藻屬分為兩支，但在Tolypella-Rothia內部，由于18S rDNA較為保守，序列變異較小，導致T.intricata與T.prolifera聚類到一支，無法分開.

18S rDNA雖較為保守，無法區分屬內個別藻種，但較適于輪藻科植物族與屬之間的分類研究，但進一步對屬內輪藻植物進行分類研究需要利用變異程度更高的序列.

3.2.2 基于rbcL基因的輪藻科植物系統發育研究 圖2為基于rbcL基因的輪藻科植物系統發育分析結果，進化樹的拓撲結構與18S rDNA所得分析結果有一定差異，進化樹沒有明顯形成兩大支，輪藻族和麗藻族沒有聚類形成單系群，各屬分支形成并系群，鳥巢藻屬作為輪藻族與麗藻屬的姐妹群出現，rbcL基因分析所得進化樹的拓撲結構與傳統形態分類結構差異較大，分子分析結果不支持形態學分類[2-4]，因此rbcL基因不適用于討論輪藻科植物科內族與屬間的分類關系.

圖1 基于18S rDNA基因的輪藻科植物分子系統進化分析Fig.1 The phylogenetic analysis of characeae based on 18S rDNA gene

在輪藻族分支內，燈枝藻屬與擬麗藻屬以100%的支持率聚類到一支，Chara-Grovesia分支的分類仍然存在混亂.在鳥巢藻屬分支中，18S rDNA基因無法區分開的T.intricata與T.prolifera兩種藻種，經過rbcL基因分析后，屬內的分類結構得到改善，因此rbcL基因較適用于鳥巢藻屬藻種的分類研究.

圖2 基于rbcL序列的輪藻科植物分子系統進化分析Fig.2 The phylogenetic analysis of characeae based on rbcL gene

3.2.3 基于atpB基因的輪藻科植物系統發育研究 基于atpB基因的輪藻科植物系統發育分析結果(圖3)與rbcL基因分析結果基本一致，輪藻族與麗藻族沒有形成兩大分支，且與rbcL基因分析結果相比，各分支的支持率較低，同時Chara-Grovesia分支輪藻植物的分類結果沒有得到改善.綜上所述，僅利用atpB單基因進行系統發育分析不能得到較好的輪藻科植物的分類結果.

圖3 基于atpB序列的輪藻科植物分子系統進化分析Fig.3 The phylogenetic analysis of characeae based on atpB gene

圖4 基于3-loci序列的輪藻科植物分子系統進化分析Fig.4 The phylogenetic analysis of characeae based on 3-loci gene

3.2.4 基于3-loci基因的輪藻科植物系統發育研究 圖4為基于18S rDNA-rbcL-atpB三基因聯合(3-loci)的輪藻科植物系統發育分析結果.3-loci所得進化樹的拓撲結構與18S rDNA分析所得進化樹結構類似，進化樹被分為輪藻族(第Ⅰ分支)與麗藻族(第Ⅱ分支)兩大分支.在第Ⅰ分支中，燈枝藻屬與擬麗藻屬聚類到一起，作為輪藻屬植物的姐妹群，三基因聯合后，輪藻屬中Chara-Grovesia分支分類混亂的問題得到解決，C. connivens與C. globularis分別以較高的支持率分開.在第Ⅱ分支中，麗藻族被分為麗藻屬和鳥巢藻屬兩大分支，兩屬內輪藻均以各自的亞屬分類到一起，得到較好的進化樹結構.

通過三基因聯合分析后，進化樹各分支的支持率得到明顯的提高，BS值多為100.同時三基因聯合可以很好的解決輪藻科植物的分類問題，無論是族與屬的分類關系，還是屬內易混種的分類，均以較高的支持率分開，得到較完美的拓撲結構，分子分類結構與形態學分類結構基本一致，支持形態學分類結構[2-4].

4 討 論

本研究的研究結果表明，從種內、種間遺傳距離和進化樹的拓撲結構來看，18S rDNA基因可將輪藻科植物分為輪藻族與麗藻族兩大支，與傳統形態學分類結構一致，較適用于輪藻科內族與屬分類關系的研究.基于rbcL，atpB基因的分析后，進化樹沒有形成明顯的兩大支，而是輪藻科各屬形成并系群，但利用rbcL與atpB基因分析后可以得到較好的鳥巢藻屬植物分類結構.三基因聯合后輪藻科植物得到較完美的進化樹，族與屬的分子分類結構與形態分類一致，同時可將易混淆的C.connivens與C.globularis區分開，從而解決輪藻屬植物分類混亂的問題.C.connivens與C.globularis兩者除分子分類上常存在混淆外，其外觀形態也有很多相似之處：莖中等粗壯，均為三列式皮層，原生列與次生列直徑相等；托葉雙輪，均退化為瘤狀突起；刺細胞單生，不發達.唯一較為突出的差別是C.connivens為雌雄異株，而C.globularis為雌雄同株.Wood和Imahori認為應將C.connivens視為C.globularis的一個變種，命名為C.globularis f. connivens R. D. Wood，且在形態學分類上他們認為雌雄是否異株不應作為輪藻植物分類的重要標準[2].但本研究結果表明，C.connivens與C.globularis兩者雖易混淆，但經過18S rDNA-rbcL-atpB三基因聯合后，可以將兩者分開，在分子水平上證明二者為不同種藻類，因此在形態學分類上應將雌雄是否異株應作為輪藻形態分類的重要標準.

除此之外，在傳統輪藻植物分類中，Wood和Imahori認為燈枝藻屬是輪藻屬與麗枝藻屬的姐妹群，同時擬麗藻屬作為輪藻屬與燈枝藻屬的姐妹群被分到較遠的一支[2].Meiers認為燈枝藻屬應作為輪藻屬植物的一種[24].但在本研究中，18S rDNA，rbcL，atpB以及三基因聯合分析所得進化樹結果均表明燈枝藻屬和擬麗藻屬的親緣關系最近，這與傳統輪藻植物分類系統較為不同.在Pérez等人的研究中也提出燈枝藻屬和擬麗藻屬可能具有較強的親緣關系[25]，同時兩者在外觀形態上也有一定的相似之處，均為托葉單輪、無皮層等[3].但由于樣本數量較少，兩者在分類上的確切問題還需進一步深入研究.

在不同的環境下，輪藻植物的外觀形態可能受到光強、水溫、營養條件、水流速度以及生長在淡水域或淡咸水域等因素的影響，但具體的作用機制尚未明確[26-27]，因此僅靠形態學對輪藻植物進行分類是不夠完善的，且不同輪藻之間有形態特征交錯，導致分類界限不清.因此在今后的研究中，應對輪藻植物分類開展更深入的研究，將傳統形態特征分類與分子分類相結合，這是今后國內輪藻植物分類研究的方向.本研究對輪藻科植物的系統發育進行了初步研究、作出了有益的嘗試，對今后輪藻分類系統的完善有一定借鑒意義，希望能夠引起更多學者對日漸稀少、有瀕臨滅絕危險的輪藻植物研究的關注.