應用超臨界流體萃取分離-氣相色譜-質譜分析法建立中藥溫郁金的指紋圖譜及其系統聚類分析

王 聰,謝 磊,董雪瑞,楊雨萱,鄭思躍

(杭州職業技術學院 臨江學院,杭州310018)

溫郁金[1]又名溫莪術、黑郁金,為姜黃屬郁金的栽培品種。將溫郁金的塊根洗凈,上籠蒸后曬干,即為溫郁金;根莖洗凈后,除去須根及糙皮,蒸熟后曬干為溫莪術;將根莖洗凈后,用刀縱切成薄片,直接曬干為片姜黃。溫郁金是一種可加工成3種中藥飲片的藥材,其主產區為浙江瑞安,氣微香,味微苦,具有活血止痛,行氣解郁,清心涼血,利膽退黃功效。根莖揮發性成分主要為倍半萜醇和倍半萜烯等活性物質[2-3]?，F代藥理研究表明,溫郁金具有良好的抗癌作用,對于癌癥研究具有很大的貢獻[4-5]。

中藥整體質量標準體系應該建立在中藥指紋學體系的基礎上,中藥指紋學體系是一種以整體性、特征性、穩健性、有效性和安全性為核心的研究中藥的全新學科體系。中藥指紋信息學為核心處理技術和關鍵方法,是揭示中藥指紋所表達的化學物質信息、生物活性與藥效信息、藥代動力學和藥劑學信息以及相關測試技術條件與方法等綜合信息的科學。中藥整體質量標準體系的出發點要立足于中藥指紋學的思路和方法,從全新視角控制中藥質量[6]。溫郁金為“浙八味”之一,具有較強的地域屬性,有關溫郁金指紋圖譜研究報道中,大多采用高效液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10-12]和光譜法[13-14]等分析方法,均為溫郁金的質量評價提供了較好的參考。但其采用的前處理方法,如水蒸氣蒸餾法、浸泡法、超聲溶劑萃取法等,均存在過程復雜、損失較大、受基質影響等問題。

超臨界流體是指溫度、壓力均高于自身臨界狀態的流體,其黏度和擴散系數與氣體相接近,而密度和溶劑化能力卻與液體相接近。超臨界流體萃取技術(SFE)為國際上最先進的物理萃取技術,能最大限度保持天然產物的活性,提高產物的提取率與產品的純度,具有安全無毒副作用、操作簡單、省時等優點,該技術在天然產物加工中的應用日益廣泛。系統聚類的基本思想是將n個樣品或變量看成n個分類,然后將距離接近(樣品聚類)或性質接近(變量聚類)的兩類合并為一類,再從n－1類中繼續尋找最接近的兩類合并一類,如此繼續,最終將所有類別合并為一支[15]。筆者已經應用SPSS軟件系統聚類分析比較了不同產地鐵皮石斛的裂解氣相指紋圖譜[16]和不同產地菊花的頂空-固相微萃取-氣相色譜(HS-SPME-GC)指紋圖譜[17]。錢華麗等[18]采用SFE萃取溫郁金中的揮發性成分,優化萃取條件為55℃、35 MPa、240 min,并采用氣相色譜-質譜法(GC-MS)對揮發性成分進行定性及半定量分析,與水蒸氣蒸餾工藝相比,SFE的回收率較之高出3倍,萃取時間縮短4倍,抗癌有效活性成分含量更高。與此文獻比較,本工作在SFE萃取過程中具有較多優勢:采用的樣品量更少,只需要30 g,而文獻中需要300 g樣品量;采用了動-靜態聯合萃取法,物料在CO2中能夠更充分的浸潤,氣流的方向多樣化同時也更節約氣流,總萃取時間(靜態萃取時間30 min和動態萃取時間90 min)為120 min,時間更少。采用正交試驗對SFE萃取條件進行優化,優化的條件略有不同,這與采用的儀器密切相關。本工作收集了14批溫郁金樣品,采用SFE-GC-MS建立了其指紋圖譜,指認其特征峰,總離子流色譜圖與NIST 14譜庫比對,并結合相關文獻對共有峰進行定性,采用系統聚類分析法對不同產地的14批溫郁金的SFE-GC-MS指紋圖譜進行分類比較,最后利用指紋圖譜對2個市售溫郁金產品進行產地鑒別和質量評價。

1 試驗部分

1.1 儀器與材料

7890A/5975C型氣相色譜-串聯質譜儀;7890A型氣相色譜儀,配氫火焰離子化檢測器(FID);SFE-2ASI型超臨界萃取儀;CP 224S型分析天平;SRA10N-50型凍干機;FW 177型中草藥粉碎機;SPSS 16.0統計分析軟件。

14批溫郁金樣品均由某溫郁金合作社提供,具體信息見表1。從藥材市場購買2批溫郁金樣品(U1、U2)作為待測樣品。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 HP-5ms石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);進樣口溫度為280℃;不分流進樣;載氣為氦氣,流量為1.0 mL·min－1。柱升溫程序:初始溫度為50℃;以15℃·min－1的速率升溫至155℃,保持1 min;再以2℃·min－1的速率升溫至220℃,保持5 min。

表1 溫郁金樣品信息Tab.1 Information of the wenyujin samples

2)質譜條件 電子轟擊離子源(EI),電離能量為70 eV;離子源溫度為230℃;質荷比(m/z)掃描范圍50～650;傳輸線溫度為280℃。

1.3 試驗方法

將溫郁金洗凈、瀝水后冷凍干燥36 h,用研缽磨碎,用中藥網篩篩取顆粒直徑小于0.425 mm的粉末樣品。稱取樣品30 g于10 mL萃取釜內,將萃取釜置于加熱箱內,連接萃取釜接口,關上箱門。調節萃取溫度為35℃,溫度達到設定值時,設定壓力為15 MPa。當溫度和壓力均到達設定值時,進行靜態萃取并開始同步計時(注意要關閉出口閥),靜態萃取時間為30 min。靜態萃取結束,同時進行動態萃取,回收萃取液。在回收瓶內加入5 mL甲醇,并將出口針沒入甲醇中。打開出口閥,調節微量閥,設置CO2氣體流量為800 mL·min－1,開始動態回收萃取液。氣動泵可將萃取釜內壓力保持在設定值區間內,動態萃取時間為40 min。按照儀器工作條件進行測定,計算溫郁金精油得率,具體見公式(1):

式中:w為溫郁金精油得率;m2為精油的質量,g;m1為溫郁金的質量,g。

2 結果與討論

2.1 正交試驗

分別對萃取溫度(A)、萃取壓力(B)、靜態萃取時間(C)、動態萃取時間(D)進行單因素試驗,以溫郁金精油得率為考察指標,采用L9(34)正交試驗表,對萃取溫度(30,35,40℃)、萃取壓力(10,15,20 MPa)、靜態萃取時間(20,30,40 min)、動態萃取時間(60,90,120 min)等4個因素在3個不同水平上按照L9(34)進行正交試驗,結果見表2。

表2 正交試驗結果Tab.2 Results of the orthogonal test

由表2可知:各因素對超臨界CO2萃取溫郁金中的精油得率的影響順序為:萃取溫度＞動態萃取時間＞萃取壓力＞靜態萃取時間。最佳萃取條件為A2B2C2D2,即萃取溫度為35℃,萃取壓力為15 MPa,靜態萃取時間30 min,動態萃取時間90 min。

采用最優條件平行萃取5次,溫郁金精油得率平均值為1.29%,該值均高于以上表2中的精油得率,由此驗證萃取條件的可靠性。

2.2 色譜行為

2.2.1 溫郁金指紋圖譜的參照峰與共有峰的選擇

按照試驗方法對14批溫郁金樣品進行測定,S3樣品的色譜圖見圖1。

由圖1可知:溫郁金CO2超臨界萃取經GCMS分析后,總離子流色譜圖中共有50多個色譜峰,選擇共有峰作為考察對象,即保留時間在40 min內的1～26號色譜峰。14批樣品的共有峰面積分別占總峰面積的85%左右,選擇保留時間為17.12 min的16號峰為參考峰,該峰為溫郁金有效成分莪術二酮、峰強度最強且穩定。

2.2.2 溫郁金指紋圖譜的建立

根據14批溫郁金樣品的色譜圖計算26個共有峰的相對保留時間α(各組分的調整保留時間與峰16的調整保留時間的比值)和峰面積百分比S(該組分峰面積占共有峰面積之和的百分比),以及各樣品中26組分的峰面積百分比S之間的最大差值[ΔS(Max)],結果見表3。

由表3可知:當α為0.296～3.342時,S＜10%,ΔS(Max)為0.17%～7.96%,按照文獻[19]要求,當S＜10%時,對ΔS(Max)不作要求。以上的結果表明:14批溫郁金樣品的SFE-GC-MS的圖譜具有較強的相似性,完全達到建立指紋圖譜的技術要求。

圖1 S3溫郁金樣品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of S3 wenyujin sample

表3 14批溫郁金樣品的SFE-GC-MS指紋圖譜數據Tab.3 SFE-GC-MS fingerprint data of 14 wenyujin samples

2.2.3 溫郁金化學成分的質譜分析

結合文獻[10-11,18,20]以及NIST 14譜庫質譜分析可知,超臨界萃取溫郁金所得揮發油基本上為倍半萜烯烴及其氧化衍生化合物。圖1和表3中的峰5、7、13～18為溫郁金中標志性揮發性產物,在抗腫瘤、抗病毒方面發揮重要作用;峰1～3為單萜類化合物,具有抗氧化、抗菌、祛痰等作用;峰4、6、8～12均為倍半萜類化合物,此類物質具有芳香性,氣味濃郁;峰19～24為倍半萜的氧化衍生物,具有芳香性、抗炎性等作用;峰25、26均為脂肪酸。

2.3 溫郁金樣品的系統聚類分析

采用SPSS 16.0軟件包中的系統聚類程序對16(14批樣品及2個市售溫郁金待測樣品)×26階(26個共有峰的相對峰面積)原始數據矩陣進行分析。方法上,數據進行標準化從－1到1,采用平方歐式距離作為間距測量變量,樣本間以組間聯接聚類法進行連接,輸出系統聚類譜系圖。

圖2為溫郁金樣品系統聚類譜系圖,橫坐標為臨界值,即類間距離,縱坐標為樣品來源地。臨界值越小,表示色譜圖相似度越高。

圖2 溫郁金樣品系統聚類譜系圖Fig.2 Hierarchical cluster analysis diagram of curcuma wenyujin samples

由圖2可知:當臨界值為9～10時,來源于瑞安市陶山、瑞安市馬嶼、瑞安市南濱分為3類,反映了這3類溫郁金的不同產地來源,瑞安市陶山鎮位于經度120°39′,緯度27°47′,瑞安市馬嶼經度120°27′,緯度27°47′,瑞安市南濱經度120°39′,緯度27°42′。產地的地理位置非常接近,因此受到當年的光照、雨水、溫度等方面影響較少,主要受土壤條件和人工種植方式影響較大;當臨界值為4～9時,來源于瑞安市陶山鎮沙一村(S1、S2)、二村(S3、S4)、三村(S5、S6)與瑞安市陶山鎮岱下村(S9、S10)、瑞安市陶山鎮樓渡(S14)分為3類,反映了瑞安市陶山鎮溫郁金與其他地方的差別;當臨界值為1～4時,各個產地的溫郁金均能得到清晰的區分;另外,2個市售溫郁金樣品U1和U2,經此相同系統聚類分析法,可判定為樣品U1產地為瑞安市陶山鎮沙二村,樣品U2產地為瑞安市馬嶼青垟。結果表明,即使是地域非常接近,系統聚類分析法也能較為全面、綜合地反映不同產地溫郁金SFE-GC-MS譜圖之間的差異,還能對市售溫郁金樣品進行產地鑒別。

本工作建立了SFE-GC-MS分析8個產地14批溫郁金樣品和2個市售溫郁金樣品的氣相色譜指紋圖譜,后進行系統聚類分析。結果表明,建立的方法既能反映溫郁金SFE-GC-MS圖譜之間的相似關系又能反映不同產地的差異,并可對市售溫郁金進行產地鑒別。