熒光猝滅法測定維生素C片和果汁飲料中抗壞血酸的含量

張愛菊,張小林

(甘肅醫學院,平涼744000)

抗壞血酸(AA)又稱為維生素C(Vc),結構中的烯二醇使其具有還原性?？箟难岵荒茉谌梭w中合成,只能從外界獲取,獲取途徑有兩條,一是水果和蔬菜;二是藥劑?？箟难岬臏y定方法主要有滴定法[1-2]、光譜法[3-5]、電化學分析法[6-7]和色譜法[8-9]等。滴定法靈敏度低,且標準溶液不穩定,不適合低含量抗壞血酸的測定。熒光法[10-11]具有檢出限低,抗干擾能力強等特點。

羅丹明B(RB)具有熒光特性,其陽離子與I3－通過靜電引力形成離子締合物,可使其熒光消失,基于碘化鉀-羅丹明B體系熒光猝滅法測定氧化性物質的研究已有報道[12-18],但尚未見碘化鉀-羅丹明B熒光反猝滅法用于還原性藥物測定的研究報道。研究發現[19-20],在弱酸性條件下將碘溶液和羅丹明B混合即可使羅丹明B發生熒光猝滅,但在碘化鉀-羅丹明B締合物形成前加入抗壞血酸,溶液重新發出熒光,其熒光強度與抗壞血酸的濃度在一定范圍內呈線性關系。本工作基于氧化還原和締合反應原理,在不需催化、加熱及長時間等待的情況下完成藥劑和果汁中抗壞血酸的快速測定,其過程不受樣品渾濁度和色度的影響,準確度高且檢出限較低(5.6×10－9mol·L－1)。目前,類似方法尚無相關報道。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

930N型熒光光度計;FA 2004N型分析天平;pHS-3C型精密pH計。

羅丹明B標準儲備溶液:1.0×10－3mol·L－1,稱取0.119 8 g羅丹明B固體,加水溶解并稀釋至250.0 mL,混合均勻。

羅丹明B標準溶液:1.0×10－4mol·L－1,稱取10.00 mL羅丹明B標準儲備溶液于100 mL容量瓶中,用水定容,混合均勻。

抗壞血酸標準儲備溶液:5.00×10－2mol·L－1,稱取0.880 0 g抗壞血酸,用水溶解并稀釋至100.0 mL,混合均勻。

抗壞血酸標準溶液:5.00×10－4mol·L－1,移取抗壞血酸標準儲備溶液1.00 mL于100 mL容量瓶中,用水定容,混合均勻。

抗壞血酸標準溶液系列:分別移取抗壞血酸標準 溶 液 0,0.50,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00 mL 于6個不同的50 mL容量瓶中,用水定容,配制成0,5,10,20,30,40,50μmol·L－1的抗壞血酸標準溶液系列。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液:0.1 mol·L－1,pH 為4.7。

碘標準溶液[21]:1.0×10－3mol·L－1。

所用試劑均為分析純,試驗用水為二次蒸餾水。

1.2 試驗方法

移取一定體積的樣品稀釋液(含抗壞血酸約0～0.35 mg)于50 mL容量瓶中,加入1.0×10－3mol·L－1碘標準溶液2.0 mL,混合搖勻,再依次加入羅丹明B標準溶液5.00 mL,乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH為4.7)5.0 mL,用水定容,混合搖勻后靜置10 min。以1.0×10－6mol·L－1羅丹明B標準溶液作為靈敏度調試液,按照儀器工作條件對其進行測定。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜

按照試驗方法對羅丹明B溶液、羅丹明B-I3－-抗壞血酸和羅丹明B-I3－溶液在455～655 nm內進行掃描,并繪制不同體系的熒光光譜,見圖1。其中羅丹明B、I3－和抗壞血酸的濃度分別為1.0×10－5,4.0×10－5,2.0×10－5mol·L－1。

結果表明:當激發波長為365 nm時,羅丹明B在580 nm處有最大熒光強度;向羅丹明B溶液中加入I3－溶液后,羅丹明B溶液的熒光猝滅,熒光發射波長未發生改變;在I3－-羅丹明B締合物形成之前加入一定量的抗壞血酸后,熒光得以重現,且熒光強度與抗壞血酸加入量有關。

2.2 試驗條件的選擇

2.2.1 羅丹明B的濃度及其用量

圖1 熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra

羅丹明B的熒光特性與其濃度息息相關[22]。當羅丹明B的濃度不小于1.5×10－5mol·L－1時,羅丹明B會形成二聚體或多聚體,激發波長和發射波長逐漸紅移,自熄滅作用增強,羅丹明B的濃度與其對應的熒光強度之間的線性消失,為了保證樣品測定過程中有足夠寬度的線性范圍和更低的檢出限,試驗選擇1.0×10－4mol·L－1的羅丹明B溶液的用量為5.00 mL,此時反應液中羅丹明B的濃度為1.0×10－5mol·L－1。

2.2.2 碘標準溶液的體積

在不含抗壞血酸的情況下,試驗考察了碘標準溶液的體積對羅丹明B熒光強度的影響,結果見圖2。

圖2 碘標準溶液的體積對羅丹明B熒光強度的影響Fig.2 Effect of volume of iodine standard solution added on fluorescence intensity of rhodamine B

由圖2可知:隨著碘標準溶液體積的增加,羅丹明B的熒光強度逐漸降低;當碘標準溶液體積為0～2.0 mL時,線性度較高;當碘標準溶液體積增加至4.0 mL時,羅丹明B的熒光強度開始趨于穩定;當碘標準溶液體積增加至6.0 mL時,羅丹明B的熒光強度幾乎不再發生變化。為了得到較為準確的測定結果,試驗選擇的碘標準溶液體積為2.0 mL。

2.2.3 體系的酸度

羅丹明B的熒光強度體現在羧基上[22],抗壞血酸在酸性條件下相對穩定。取抗壞血酸標準溶液2.00 mL,固定其他條件,在溶液中加入不同體積的0.1 mol·L－1HCl和0.1 mol·L－1NaOH 溶液,按試驗方法考察了在不同酸度體系下羅丹明B的熒光強度,結果見圖3。

圖3 體系的酸度對羅丹明B熒光強度的影響Fig.3 Effect of acidity of the system on fluorescence intensity of rhodamine B

由圖3可知:隨著體系pH的增加,游離態羅丹明B的羧基開始電離,并且電離程度逐漸增大,吸電子能力逐漸減弱,熒光強度逐漸增大;當體系pH為4.0～8.0時,羅丹明B的熒光強度趨于穩定;當體系的pH大于9.0時,締合物中的碘發生歧化,羅丹明B的熒光強度繼續增大。這說明pH為4.0～8.0時,有利于羅丹明B和I3－發生締合,也有利于抗壞血酸氧化,試驗選擇了pH為4.7的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液作為反應介質。

2.2.4 反應溫度與反應時間

移取抗壞血酸標準液2.00 mL進行試驗,試驗考察了反應溫度與反應時間對羅丹明B熒光強度的影響。結果發現:當反應溫度為20～35℃時,羅丹明B的熒光強度較大且變化幅度較小。試驗選擇的反應溫度為常溫(25℃)。

抗壞血酸與I3－反應速率較快,加入羅丹明B標準溶液后黃色瞬間變淺以至消失。在室溫下,羅丹明B與I3－在8 min內反應完全,且其熒光強度在40 min內保持穩定。試驗選擇加入羅丹明B靜置10 min后測定體系的熒光強度。

2.2.5 試劑的加入順序

試驗考察了抗壞血酸、碘和羅丹明B等3種試劑的加入順序對體系熒光強度的影響。結果發現:以抗壞血酸、碘和羅丹明B的順序加入時,體系最穩定,且熒光強度相對較高,這是由于I3－和締合物羅丹明B-I3－與抗壞血酸之間的反應速率存在差異,I3－與羅丹明B形成的離子締合物是疏水的,在溶液中很快沉淀[23],抗壞血酸無法與其完全反應。試驗選擇以抗壞血酸、碘和羅丹明B的順序加入這3種物質。

2.3 共存離子的影響

針對藥物中經常使用的賦形劑、添加劑及水果中的共存物質,試驗選擇了淀粉、葡萄糖、糊精、乳糖和硬脂酸等干擾物質以及Ca2＋、Mg2＋和Al3＋等陽離子進行干擾試驗。固定抗壞血酸用量,在優化條件下進行干擾試驗。結果表明:測定誤差在±5%內時,50倍的乳糖、硬脂酸、淀粉、糊精及100倍的上述3種金屬陽離子對測定結果均無干擾。

2.4 標準曲線和檢出限

按照試驗方法對抗壞血酸標準溶液系列進行測定,以抗壞血酸的濃度為橫坐標,與其對應的熒光強度為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:抗壞血酸的濃度在40μmol·L－1內與其對應的熒光強度之間呈線性關系,線性回歸方程為y＝5.330x＋33.81,相關系數為0.995 3。

以3倍的標準偏差與標準曲線斜率的比值計算方法的檢出限(3s/k)為5.6×10－9mol·L－1。

2.5 樣品分析

2.5.1 藥劑分析

取標示量為50 mg/片的抗壞血酸片(維生素C片)5片,研磨后混合均勻,取其十分之一(相當于25 mg)藥粉于小燒杯中,用水溶解并轉移至250 mL容量瓶中,用水定容,所得溶液過濾后,取1.00 mL濾液,按照試驗方法進行測定,結果見表1。

取抗壞血酸注射液(2 mL,0.5 g/支)0.10 mL于250 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,混合搖勻。移取上述溶液1.00 mL,按照試驗方法進行測定,結果見表1。

試驗進一步對上述抗壞血酸片劑和抗壞血酸針劑樣品進行加標回收試驗,每個加標樣品平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表1。

表1 實際樣品中抗壞血酸的分析結果(n＝6)Tab.1 Analytical results of ascorbic acid in substantial samples(n＝6)

由表1可知:抗壞血酸片劑樣品和抗壞血酸針劑中抗壞血酸的加標回收率分別為97.4%,98.4%,測定值的RSD分別為2.3%,1.7%,說明方法具有良好的精密度。根據測定結果推算出樣品中抗壞血酸的含量,片劑抗壞血酸為49.63 mg/片,針劑抗壞血酸為0.51 g/支,與其標示量基本一致,說明方法具有良好的準確度。

2.5.2 果汁分析

分別采用本法和碘量法對橙汁味、蜜桃味和葡萄味等3種果汁飲料樣品進行測定,計算2種不同分析方法測定結果的相對誤差,結果見表2。

表2 抗壞血酸的測定結果Tab.2 Results of determination of ascorbic acid

由表2可知:所有樣品中實際測得抗壞血酸含量均在商品標示含量范圍內,且相對誤差均小于5%。

羅丹明B-碘溶液體系間接測定抗壞血酸反應現象明顯,操作步驟簡便,所得結果準確,檢出限低,建立了一種靈敏度高、選擇性好、線性范圍較寬的測定抗壞血酸的方法。該方法在測定過程不使用任何有毒溶劑,相對于其他相關抗壞血酸的測定方法更環保。