Sdr9c7+/-小鼠的生長及高脂飼喂條件下血液生理生化指標分析

曾志棚，周 潔，盧偉敏，陳俏媛，賀思諾，林萬華*

(1. 廣西高校干細胞與醫藥生物技術重點實驗室(廣西師范大學)，廣西 桂林 541006；2. 廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006；3. 廣西師范大學 校醫院，廣西 桂林 541006)

短鏈脫氫/還原酶蛋白(short-chain dehydrogenase reductase, SDR)超家族是當前發現的最大蛋白家族之一，可在所有生命體內(包括古細菌、細菌和真核生物)發現。目前人們已在人類基因組中發現了75個SDR蛋白[1]，已有若干個SDR基因被證實與阿爾茨海默癥、癌癥和肥胖等的發生有關[2-5]。SDR9C7基因是短鏈脫氫/還原酶(SDR)蛋白超家族成員之一，首先從胚胎成纖維細胞中分離克隆得到，在成年鼠和成人體內只有肝臟組織特異性高表達[6]。Takeichi等[7]發現，當SDR9C7基因純合缺失突變時，可能會造成角質細胞中板層顆粒脂質的異常代謝和合成缺陷，導致角質層細胞間脂質缺乏，進而引起板層魚鱗病。而Lindholm-Perry等[8]則發現在低料肉比的肉牛中，腸系膜脂肪組織中Sdr9c7等基因的表達增高，致使視黃酸的合成增多，而視黃酸的增加可能在減少這些動物的體質量和肥胖方面發揮作用。由于Sdr9c7基因對體質量和肝臟脂肪代謝的影響尚不清楚，Sdr9c7基因敲除后會導致純合子小鼠出生后死亡(另文報道)，無法得到純合型Sdr9c7基因敲除小鼠，因此本文使用雜合子小鼠與野生型小鼠分組對Sdr9c7+/-小鼠的生長發育、高脂飼喂條件下血液生理生化指標及肝臟石蠟組織切片進行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sdr9c7+/-小鼠由本課題組設計，委托賽業(廣州)生物科技有限公司(Cyagen Biosciences Inc)運用TALEN 技術靶向Sdr9c7基因進行敲除而得。小鼠飼養在無特定病原體(specific pathogen free)級動物房，每日晝夜周期為12 h，室內溫度保持(25±2) ℃，自由采食和飲水。

1.2 材料與試劑

鼠尾裂解液(100 mmol/L Tris-Cl、5 mmol/L EDTA、200 mmol/L NaCl、20 g/L SDS)，2×Taq PCR Master Mix(購自Tiangen公司)，波氏固定液、二甲苯、蘇木素和伊紅染色液(購自索萊寶公司)。普通飼料購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。高脂飼料購自上海華雅思創生物科技有限公司(Research Diets，貨號D12492(滅菌))，其熱量構成比為碳水化合物20%、脂肪60%、蛋白質20%，總熱量為5.24 kcal/g。葡萄糖(GLU)、血清總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度膽固醇(LDL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶 (AST)、尿素(BUN)、肌酐 (CREA)等測定試劑購自上海復星長征醫學科學有限公司。

1.3 小鼠基因型鑒定

小鼠出生1周后，對其進行編號并采集鼠尾組織提取DNA，PCR擴增DNA，1%凝膠電泳檢測擴增產物條帶大小無誤后，將PCR產物交由天一輝遠基因科技有限公司測序，根據測序結果確定小鼠的基因型。

1.4 普通飼料和高脂飼料飼喂條件下小鼠生長曲線繪制

以分別來自8窩的同周齡雜合子型(Sdr9c7+/-) 和野生型(Sdr9c7+/+)8對雄性小鼠作為實驗用鼠，分為mSdr9c7+/+組和mSdr9c7+/-組，普通飼料飼喂，每周稱體質量至16周齡，繪制生長曲線。同樣方法取8對雄性小鼠，5周齡時開始飼喂高脂飼料，每周稱體質量至28周齡，繪制生長曲線。

1.5 高脂飼喂小鼠血清采集及各項生化指標測定

高脂飼料喂養至15和28周齡時，鼠尾采血法收集0.2～0.3 mL血液至1.5 mL離心管中，室溫靜置30 min，血液凝固析出血清，2 000 r/min離心10 min后分離出血清，用全自動生化分析儀(迪瑞 CS-600B)檢測小鼠的GLU、TCHO、TG、LDL、ALT、AST、BUN、CREA等生理生化指標。

1.6 高脂飼喂小鼠肝臟系數測定和組織石蠟切片

高脂喂食28周齡時，眼球放血法處死小鼠，將完整肝臟取出，PBS液清洗后用紙巾吸去多余PBS并稱量，計算肝臟系數： 肝臟系數=肝臟質量/體質量。

1.7 小鼠組織石蠟切片制備與觀察

將肝臟組織剪成厚度0.3～0.5 cm，長寬不超過1 cm的小塊，用波氏固定液固定24 h。取已固定好的肝臟組織流水沖洗12 h，通過系列梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(10 μm厚)、二甲苯和系列梯度酒精脫蠟復水，蘇木精-伊紅染色法染色，中性樹脂封片，在普通光學顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織石蠟切片并拍照保存，用Image J軟件分析40倍組織切片圖像中肝細胞脂質空泡面積占總面積的百分比。

2 結果

2.1 小鼠基因型鑒定

野生型測序圖譜中小鼠含有完整 (AGCTGCAGACC) 片段，雜合子小鼠的測序圖譜中(AGCTGCAGACC) 片段缺失，且其后出現2個峰的疊加，如圖1所示。

圖1 小鼠基因型測序圖譜Fig. 1 Genotype sequencing map of mouse

2.2 小鼠生長曲線

普通飼料喂養或高脂飼料喂養條件下，與野生型小鼠(mSdr9c7+/+)相比，雜合子小鼠(mSdr9c7+/-)正常生長發育與繁殖，二者的體質量生長曲線無顯著差異，詳見圖2和圖3。

圖2 普通飼料喂養條件下野生型小鼠(mSdr9c7+/+)與雜合子小鼠(mSdr9c7+/-)的生長曲線Fig. 2 Growth curve of wild type mice (mSdr9c7+/+) and heterozygous mice (mSdr9c7+/-) fed with regular chow

圖3 高脂飼料喂養條件下野生型小鼠(mSdr9c7+/+)與雜合子小鼠(mSdr9c7+/-)的生長曲線Fig. 3 Growth curve of wild type mice (mSdr9c7+/+) and heterozygous mice (mSdr9c7+/-) fed with high-fat diet

2.3 肝臟系數

高脂飼料喂養24周后，雜合子小鼠(mSdr9c7+/-)的肝臟系數(0.045 0±0.002 9)與野生型小鼠(mSdr9c7+/+)的肝臟系數(0.042 0±0.002 6)相比，二者并無顯著差異(P>0.05)，如圖4所示。

圖4 高脂飼料喂食24周后小鼠肝臟系數Fig. 4 Liver coefficient of mice after 24 weeks of high-fat diet

2.4 小鼠肝臟組織石蠟切片

高脂飼料喂食24周后，兩組小鼠的肝臟均發生明顯的脂肪變性，光學顯微鏡下觀察到肝細胞脂質空泡明顯形成，但兩組間空泡面積并無顯著差異(mSdr9c7+/+占比為(54.20±1.062)%，mSdr9c7+/-占比為(55.68±0.931)%)，如圖5所示。

圖5 高脂飼料喂食24周后野生型小鼠(mSdr9c7+/+)與雜合子小鼠(mSdr9c7+/-)的肝臟組織石蠟切片Fig. 5 Paraffin sections of liver tissue of wild type mice(mSdr9c7+/+) andheterozygous mice (mSdr9c7+/-) after 24-week high-fat diet

2.5 血液生理生化指標

當小鼠高脂飼料喂食11周后，與mSdr9c7+/+組相比，mSdr9c7+/-組的各項血液生理生化指標無顯著差異(P>0.05)；而當喂食24周后，與mSdr9c7+/+組相比，mSdr9c7+/-組的谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶 (AST)的酶活性顯著增高(P<0.05)，但葡萄糖(GLU)、血清總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度膽固醇(LDL)、尿素(BUN)、肌酐 (CREA)等指標無顯著差異(P>0.05)，如表1所示。

表1 高脂飼料喂食后小鼠的各項血液生理生化指標

注：與mSdr9c7+/+相比，*表示P<0.05。

3 討論

本文實驗發現Sdr9c7+/-雜合子小鼠的生長發育未受到明顯影響，與野生型小鼠相比生長曲線無顯著差異。高脂飼料喂食小鼠制備肥胖動物模型是目前研究肥胖、高脂血癥及肝臟非酒精性脂肪性肝病的通用手段，血液生理生化指標對脂肪肝的診斷和鑒別有重要的參考意義[9-10]。本文通過測定高脂飼料喂食后小鼠的各項血液生理生化指標，發現用于檢測血糖血脂的生理指標(包括GLU、TCHO、TG、LDL等)在雜合子小鼠和野生型小鼠兩組間并無顯著性差異，兩組間肝臟系數亦無明顯差異，肝臟組織的石蠟切片結果也顯示兩組小鼠的肝臟組織結構無明顯差異，由此推測Sdr9c7基因沒有參與調控肝臟的脂肪沉積。此外，本文還檢測了BUN和CREA的生理指標，結果顯示兩組間并無顯著性差異。但在高脂喂食24周后，雜合子小鼠血清中AST和ALT的含量較野生型小鼠的含量顯著增加(P<0.05)。AST和ALT是檢測肝功能的主要指標，當發生肝損傷時，其含量上調，而在成年鼠和成人體內SDR9C7基因的表達呈肝臟組織特異性高表達[6]，因此推測Sdr9c7可能與肝臟的炎癥發生有一定的聯系。相關報道表明SDR9C7基因的表達與皮炎相關[7，11-12]。Sdr9c7+/-雜合子小鼠在高脂飼料飼喂條件下發生更嚴重的肝炎的機制有待進一步研究。