黃瓜酵素凍干粉的制作工藝研究

皇甫俊靜，趙鈺瑩，冉 浪，馮美玲，張 豪，李次力

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076）

黃瓜原產于喜馬拉雅山南麓，西漢時期由張騫出使西域帶回中原地區，根據《拾遺錄》 上說：“隋大業四年避諱，改胡瓜為黃瓜?！秉S瓜含水分約95%，性味甘涼，有清熱利水、解毒的功效，且能治四肢浮腫、清肺熱、解火毒，可降低膽固醇[1]。黃瓜富含蛋白質、糖類、維B2、維C、尼克酸、鈣、磷、鐵等營養物質，能強心降壓、預防心肌過度緊張和動脈粥樣硬化，還可增強記憶力[2]、安神定志、輔助治療失眠。此外，黃瓜中的黃瓜酶具有強生物活性，可促進機體的新陳代謝；丙醇二酸可抑制人體內糖類轉化為脂肪，阻止體內脂肪堆積，具有減肥和預防冠心病的功效[3]。

李時珍的《本草綱目》中有紅曲藥用價值的記載：“消食活血，健脾燥胃，治赤白痢下水谷，釀酒，破血行藥勢，殺山嵐瘴氣，治打撲傷，治女人血氣痛及產后惡血不盡，擂酒飲之，良[4]”。紅曲菌絲體蛋白質含量高達30%左右，含17 種氨基酸，其中必需氨基酸占7%左右[5]。根據中醫理論，利用紅曲與中藥材復配，中醫理論認為高血脂基本病機為脾失健運、痰濁內生，健脾化痰、活血化瘀是治療高血脂癥的根本原則[6]，若與黃瓜合理配伍，從本源上改善高血脂患者體質，則可發揮更大的作用。

酵素是一種在日本和我國臺灣非常流行的植物性功能食品，又稱為酶，是產生于生物體內具有催化作用的活性大分子[7]。酵素作為一種生物催化劑參與機體代謝活動[8-10]。目前，關于使用紅曲酶對黃瓜進行二次發酵的代餐酵素鮮有報道，試驗在前期試驗的基礎上，選擇溫度、pH 值、碳源補充量3 個主要因素探究其對發酵代謝物酶活性的影響程度，以期為優質果蔬代餐的生產提供參考。

試驗以黃瓜為原料，發酵工業中常用的酵母菌和紅曲酶菌為發酵菌種，通過榨汁、發酵、離心、干燥等步驟，制成黃瓜酵素產品，以POD 酶活性為評價指標，對黃瓜酵素的發酵工藝進行優化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

新鮮黃瓜、酵母菌、紅曲酶菌、白砂糖，均為市售；過氧化氫、愈創木酚，均為化學純；醋酸、醋酸鈉，均為分析純。

1.2 試驗儀器與設備

BPH-9162 型精密恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；DT5-1 型低速自動平衡離心機，北京時代北利離心機有限公司產品；JA5003 型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；722 型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產品；Pilot2-4LD 型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司產品；PHS-2F型pH 計，上海圣科儀器設備有限公司產品。

1.3 工藝流程

黃瓜→冷凍榨汁→加入蔗糖調配→酵母活化后接種→一次發酵→過濾→滅菌→紅曲酶活化后接種→二次發酵→過濾→滅菌→酵素原液→冷凍干燥→酵素粉。

1.4 操作要點

（1）原材料預處理。用清水將新鮮的黃瓜清洗干凈后，冷凍2～3 d（5～10 ℃），自然解凍、去皮、切碎，添加與黃瓜同質量的水于榨汁機中榨汁，經紗布過濾后，再用離心機過濾[11]。

（2）一次發酵。取一定量酵母置于質量濃度為30 g/L 的蔗糖溶液中，混勻，于35 ℃條件下恒溫水浴活化30 min；黃瓜汁中加入活化酵母種子液，攪拌均勻后置于培養箱中恒溫發酵。

（3）二次發酵。將一定量紅曲霉用適量水潤濕，于35 ℃條件下恒溫水浴活化1 h；將活化后的紅曲霉和殺菌后的一次發酵液混勻后置于培養箱中恒溫發酵。

（4）過濾、殺菌。一次或二次發酵完畢需將發酵液真空抽濾，濾液于65 ℃條件下恒溫水浴30 min，而后自然冷卻至室溫[12]。

（5）冷凍干燥。將發酵液分批導入培養皿中，置于-20 ℃以下的低溫冷凍冰箱中冷凍48 h，再放入冷凍干燥機中，先在-80 ℃條件下冷藏24 h，于-80 ℃條件下抽真空24 h，最終得到粉末狀產品[13]。

1.5 酵母菌一次發酵單因素試驗

1.5.1 酵母菌發酵的最佳發酵溫度確定

經預試驗后，為使黃瓜汁發酵充分，初始pH 值5.0，補充碳源量7%，發酵溫度分別設為22，25，28，31，34，37 ℃，發酵24 h；待發酵完畢，從培養箱中取適量發酵液檢測，以POD 酶活性為測定指標，確定初始發酵的最佳發酵溫度。

1.5.2 酵母菌發酵所需最佳發酵時間確定

將恒溫發酵溫度34 ℃，補充碳源量7%，初始pH 值 5.0，發酵時間依次設為 18，20，22，24，26，28 h；待發酵完畢，從培養箱中取適量發酵液檢測，以POD 酶活性為測定指標，確定初始發酵所需最佳發酵時間。

1.5.3 酵母菌發酵的最佳初始pH 值確定

將發酵溫度恒定34℃，補充碳源量7%，初始pH 值分別設為 3.8，4.2，4.6，5.0，5.4，6.0，控制恒溫26 h；待發酵完畢，從培養箱中取適量發酵液檢測，以POD 酶活性為測定指標，確定初始發酵的最適初始pH 值。

1.5.4 酵母菌發酵最佳碳源補充量確定

由預試驗結果，將發酵溫度恒定34 ℃，初始pH 值5.0，補充碳源量依次設置為1%，3%，5%，7%，9%，11%，恒溫26 h 發酵后，從培養箱中取適量發酵液檢測，以POD 酶活性為測定指標，確定初始發酵的最佳補充碳源量。

1.6 正交試驗優化黃瓜酵素酵母菌發酵的最佳發酵條件

經單因素試驗可知，發酵溫度、發酵時間、初始pH 值、碳源補充量是影響酵母菌初次發酵黃瓜汁的主要因素。因此，以POD 活性為評價指標來設計正交試驗，探究酵母菌初始發酵黃瓜汁的最佳制備工藝。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交驗因素與水平設計

1.7 紅曲霉菌發酵單因素試驗

1.7.1 確定紅曲霉菌發酵的最佳初始pH 值

初始發酵pH 值會影響發酵產品的發酵速率和品質。由預試驗測定結果，將發酵溫度恒定34 ℃，紅曲酶接種量10%，分別調節pH 值為3，4，5，6，發酵50 h 后，從培養箱中取適量發酵液檢測，以POD 酶活性為測定指標，確定紅曲霉菌發酵黃瓜的最適pH 值。

1.7.2 確定紅曲霉菌發酵的最佳紅曲霉接種量

恒溫發酵溫度34 ℃，pH 值4.0，紅曲霉接種量分別為0，5%，10%，15%，20%，在此基礎上發酵50 h 后，從培養箱中取適量發酵液檢測，以POD 酶活性為測定指標，確定紅曲霉菌發酵黃瓜的最佳接種量。

1.7.3 確定紅曲霉菌發酵的最佳發酵時間

發酵溫度恒定34 ℃，pH 值4.0，紅曲霉接種量10%，在此基礎上發酵時間依次設為40，50，60，70 h 進行發酵。發酵完畢后，從培養箱中取適量發酵液檢測，以POD 酶活性為測定指標，確定紅曲霉菌發酵黃瓜的最佳發酵時間。

1.8 二次發酵產物真空冷凍干燥

將發酵液分批導入培養皿中，置于低溫冷凍冰箱中，于-20 ℃以下冷凍48 h，再放入冷凍干燥機中先-80 ℃冷藏24 h，再進行-80 ℃真空冷凍干燥，真空度5～15 Pa，干燥時間24 h，最終得到黃瓜汁酵素粉末狀產品。

1.9 POD 活性測定

發酵液全部置入離心管，以轉速5 000 r/min 離心，于4 ℃條件下保持2 min，酶的粗提取液為上清液。將4 mL 反應液（醋酸緩沖液2 mL，酶液1 mL，0.05 mol/L 愈創木酚 1 mL）和 1 mL 3%的 H2O2加入試管，即刻搖勻并快速倒入1 mL 比色皿中，于波長470 nm 處用722 型可見分光光度計比色，即刻記錄吸光度，隔30 s 記一次，共記5 min，用緩沖液取代酶液作對照。

式中：ΔOD——反應起始速度階段的吸光度差值，比色波長為470 nm；

Δt——ΔOD 對應的時間，min；

Δt/ΔOD——直線部分的斜率，此段吸光度與反應時間成正比；

V1——提取酶液的總體積，mL；

V2——測定時取用的提取酶液體積，mL；

W——黃瓜樣品的鮮質量，g；

0.01 ——以吸光度（ΔOD）改變0.01 為1 個酶活單位 （U）[14-16]。

2 結果與分析

2.1 酵母菌發酵的試驗結果與分析

2.1.1 酵母菌發酵單因素試驗

（1）發酵溫度對一次發酵酶活性的影響。

發酵溫度對一次發酵后酶活性的影響見圖1。

由圖1 可得以下結論，發酵溫度對發酵效果有顯著影響，當發酵溫度小于34 ℃時，酶活性隨時間增加迅速增加；當發酵溫度大于34 ℃時，酶活性有驟減趨勢。因此，最佳發酵溫度為34 ℃。

（2）發酵時間對一次發酵酶活性的影響。

發酵時間對一次發酵后酶活性的影響見圖2。

圖1 發酵溫度對一次發酵后酶活性的影響

圖2 發酵時間對一次發酵后酶活性的影響

由圖2 可知，發酵時間對發酵效果有顯著影響。當發酵時間小于26 h 時，酶活性隨時間增加而迅速增加；當發酵時間大于26 h 時，酶活性有下降趨勢。因此，最佳發酵時間為26 h。

（3）初始pH 值對一次發酵酶活性的影響。

初始pH 值對一次發酵后酶活性的影響見圖3。

圖3 初始pH 值對一次發酵后酶活性的影響

由圖3 可知，初始pH 值對一次發酵后酶的活性影響趨勢較顯著，當初始pH 值為5.0 時，發酵效果最佳。因此，發酵最佳初始pH 值為5.0。

（4）碳源補充量對一次發酵酶活性的影響。

碳源補充量對一次發酵后酶活性的影響見圖4。

圖4 碳源補充量對一次發酵后酶活性的影響

由圖4 可知，碳源補充量對二次發酵后酶的活性影響趨勢較顯著，相比之下，當發酵碳源補充量為3%時，發酵效果最佳。因此，發酵最佳碳源補充量為3%。

2.1.2 酵母菌發酵的正交試驗

黃瓜酵素酵母菌發酵正交試驗結果見表2，黃瓜酵素酵母菌發酵正交試驗方差分析見表3。

表2 黃瓜酵素酵母菌發酵正交試驗結果

表3 黃瓜酵素酵母菌發酵正交試驗方差分析

由表2 可知，以POD 酶活性為評價指標測得發酵液中POD 酶活性知，4 個因素對酵母菌發酵黃瓜汁有不同影響，且影響作用大小不同。按影響作用大小排序為A>B>C>D，最佳組合的結果為A1B3C1D4，其中發酵時間對整個試驗的影響作用較其他3 個影響因素偏小。

2.2 紅曲霉菌發酵單因素試驗

2.2.1 發酵pH 值對二次發酵后酶活性的影響

發酵pH 值對二次發酵后酶活性的影響見圖5。

由圖5 可知，發酵pH 值對二次發酵后酶的活性影響趨勢較顯著，當發酵pH 值為4.0 時，發酵效果最佳。因此，發酵最佳pH 值為4.0。

2.2.2 紅曲霉接種量對二次發酵后酶活性的影響

紅曲霉菌接種量對二次發酵后酶活性的影響見圖6。

圖5 發酵pH 值對二次發酵后酶活性的影響

圖6 紅曲霉菌接種量對二次發酵后酶活性的影響

由圖6 可知，紅曲霉菌接種量對發酵效果的影響較顯著，當接種量小于10%時，酶活性隨接種量的增加而增大；但當其接種量大于10%時，酶活性有下降趨勢。因此，紅曲霉菌的最佳接種量為10%。

2.2.3 發酵時間對二次發酵后酶活性的影響

發酵時間對二次發酵后酶活性的影響見圖7。

圖7 發酵時間對二次發酵后酶活性的影響

由圖3 可知，發酵時間對發酵效果有顯著影響，當發酵時間小于50 h 時，酶活性隨時間增加而迅速增加；當發酵時間大于50 h 時，酶活性則隨發酵時間增加迅速減小。因此，最佳發酵時間為50 h。

2.3 真空冷凍干燥二次發酵產物

該產品色澤呈紅色，無小塊聚集的粉末，口感清新，有香氣，有甜味；理化指標為水分含量≤7%，過氧化物歧化酶含量≥30±3 U/g。

3 結論

以黃瓜為原料，采用工業生產中常用的釀酒酵母和紅曲霉菌為菌種，通過正交試驗和單因素試驗，得到了一次發酵和二次發酵的最佳條件。一次發酵的最佳條件為發酵溫度34 ℃，初始pH 值5.0，碳源補充量3%，發酵時間26 h；二次發酵的最佳條件為發酵時間50 h，發酵pH 值4，紅曲霉接種10%。冷凍干燥的最佳條件為-80 ℃真空冷凍干燥，真空度5～15 Pa，時間24 h，最終得到粉末狀酵素產品。在今后的研究中，可嘗試用其他菌種發酵，豐富產品的營養和保健功能，增加產品的附加值。