百歲老人腸道雙歧桿菌分離鑒定研究

王少博，陳樹興，程晶晶，陳拾 ，茹元樸，劉風英，陳歷俊

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽 471023；2.洛陽市種子管理站，河南洛陽 471002；3.國家母嬰乳品健康工程技術研究中心，北京 100163；4.北京市乳品工程技術研究中心，北京 100163）

0 引言

人體腸道作為人體微生物的主要棲息場所，是人類最為龐大和復雜的微生態系統。人體腸道的主要益生菌是一類對宿主起到有益作用的活性微生物，主要分為乳酸菌類、雙歧桿菌類、酵母菌類、益生芽孢桿菌類、丁酸梭菌類等5 種[1]。雙歧桿菌作為評價人體腸道的健康與否的重要標志物，在人類的長期進化中與宿主形成互惠共生的關系[2]。作為人體腸道的一種重要益生菌，雙歧桿菌通過定植于機體腸道黏膜細胞，參與機體免疫、營養、消化和保護等一系列生理過程[3]，起到提高免疫力、調節腸道菌群結構、促進營養成分吸收等作用[4]。

人體的健康狀況與腸道微生物的種類、多樣性有著直接的關系，與益生菌的種類與數量呈正相關[5]。美國貝勒醫學院Han B 等人[6]研究發現腸道微生物的單個基因與宿主壽命的關系，揭示腸道微生物與健康長壽的重要作用。Wang F 等人[7]研究長壽老人腸道雙歧桿菌結構的關系，顯示長壽老人腸道雙歧桿菌更為復雜和多樣，且數量顯著增加，所以百歲老人的腸道雙歧桿菌就更有分離和研究的價值。烏云等人[8]在分離新生兒腸道雙歧桿菌時，利用莫匹羅星鋰鹽和X-Gal 的改良基礎培養基快速分離雙歧桿菌，并結合全自動微生物系統和API 20A 試劑條進行菌種鑒定。趙笑笑等人[9]利用改良的MRS 培養基的從嬰兒糞便中分離到5 株雙歧桿菌菌株，并通過16S rDNA 測序分別鑒定出在其菌種種類。X-Gal全稱5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，是β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的顯色底物，水解之后呈現藍色。所有具有活性的β-半乳糖苷酶的微生物，都可以分解X-Gal，使其菌落周圍呈現泛藍的現象[10]。

對于使用X-Gal 分離與鑒定雙歧桿菌菌株，已經有不少報道與研究。但是雙歧桿菌作為嚴格厭氧菌，X-Gal 用于雙歧桿菌的分離并不是該菌屬的特異性指示劑，從糞便中分離較為困難，分離方法仍然不夠細致具體。試驗利用X-Gal 和莫匹羅星鋰鹽改良的雙歧桿菌BS 培養基作為糞便分離培養基，采集百歲老人糞便樣品，進行糞便樣品采樣液的篩選，結合16S rDNA 的菌種鑒定，總結出在糞便中利用X-Gal 分離雙歧桿菌的過程中顯色菌落的大致范圍。以期為后續研究者在腸道雙歧桿菌的分離與鑒定提供參考基礎和方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糞便樣品采集管，美國stratec 分子科技公司提供；雙歧桿菌BS 培養基、莫匹羅星鋰鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽，青島海博生物提供；X-Gal（-20 ℃），上海源葉生物公司提供；吐溫80、甘油三酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、甘油，均為分析純，天津德恩化學試劑公司提供；API50CH 生化反應試劑條，法國生物梅里埃公司提供；16S rDNA 27F-1492R 通用PCR 擴增引物、4S GelRed 核酸染料、Taq PCR Master Mix（2x，blue dye）、DNA 分子量標準Marker F+（200～2000 bp），上海生工生物工程提供；E.Z.N.A.R soil 試劑盒，美國歐米伽生物科技公司提供；瓊脂糖，美國Genview 科技公司提供；Tris-base，合肥Biosharp 生命科學公司提供。

CYS 緩沖液即L-半胱氨酸磷酸鹽緩沖液：L-半胱氨酸鹽酸鹽0.20 g，磷酸氫二鈉2.40 g，磷酸二氫鉀 1.80 g，吐溫80 0.24 g，于400 mL 純化水中，調節pH 值為6.8～7.0，滅菌條件121 ℃，15 min。

1.2 儀器與設備

超凈無塵工作臺，蘇州凈化（江蘇）有限公司產品；DH-600 型生化培養箱，北京科偉永興儀器公司產品；A05077 型厭氧培養罐，美國基因科學公司產品；ABI GeneAmp R 9700 型PCR 儀，美國應用生物系統公司產品；H1650 型臺式高速離心機，蘇州迅博科學儀器公司產品；DYY-6C 型穩壓穩流型電泳儀，上海博通化學科技有限公司產品；Gel Doc XR+型凝膠成像系統，美國伯樂BIO-RAD 公司產品；NanoDrop 2000 型紫外-可見分光光度計，美國賽默飛世爾科技公司產品。

1.3 糞便樣本的采集

在洛陽市民政局的幫助下，征集并篩選的共計6 組洛陽當地百歲老人志愿者（編號A、B、C...F），篩選條件為無重大疾病且1 月內無抗生素的攝入。使用無酶無菌且內裝有3 種不同采樣液的糞便樣品管，采集老人的新鮮糞便作為樣本，并選取了1 名1 周歲左右的嬰兒新鮮糞便作為對照樣本，樣品采集后儲存于冰盒內，并于2 h 內運送到實驗室進行后續分離鑒定。

1.4 采樣液的篩選

3 種采樣液分別為雙歧桿菌BS 培養基、25%甘油溶液和0.9%生理鹽水溶液，選擇CYS 緩沖液（L-半胱氨酸磷酸鹽緩沖液：L-半胱氨酸鹽酸鹽0.20 g，磷酸氫二鈉 2.40 g，磷酸二氫鉀 1.80 g，吐溫80 0.24 g，于 400 mL 純化水中，調 pH 值為 6.8～7.0，滅菌條件121 ℃，15 min）作為稀釋液。

使用CYS 緩沖液作為樣品稀釋液[11]，渦旋振蕩制成懸液，并用CYS 溶液稀釋，將稀釋液以倒平板方式接種于添加了X-Gal（終質量濃度0.06 g/L）和莫匹羅星鋰鹽（終質量濃度4 g/L）雙歧桿菌BS 固體培養基中，按照國標方法GB 4789.35—2010[12]進行顯色菌落總數計數，3 組重復試驗取平均菌落總數計數（CFU/g），并比較結果。

1.5 糞便樣品的處理、分離及篩選

使用雙歧桿菌BS 培養基作為采樣液的樣品，渦旋振蕩制成均勻懸液，然后依次用無菌CYS 緩沖液進行梯度稀釋至1×10-6。選取其中適宜的幾個稀釋度的樣品懸液1 mL 采用倒平板的方式接種于改良的雙歧桿菌BS 培養基上，每個稀釋度至少平行3 個平板。放入厭氧培養罐中，于37 ℃條件下恒溫厭氧培養48 h 后，并進一步進行梯度稀釋和劃線純化分離，獲得鏡檢純菌株。

1.6 鏡檢純菌株的生化鑒定和有機酸代謝產物測定

酶試驗時，挑取固體培養基上菌落一接種環，置于潔凈試管內，滴加3%過氧化氫溶液2 mL，于0.5 min 內發生氣泡者為陽性，不產氣泡者為陰性[13]。

對過氧化氨酶試驗呈陰性者進行純培養，收集整個平皿上所有菌落制成濃菌懸液，按照API50CH 說明書接種試劑條。試劑條于37 ℃條件下厭氧培養48 h后判讀結果。同時，用生理鹽水稀釋上述濃菌懸液至相當于0.5 麥氏濁度后，接種乳酸菌成套生化鑒定管，于37 ℃條件下需氧培養24～48 h 后判讀結果[14]。

用滅菌竹簽挑取純菌株接種PYG 液體培養基，于37 ℃條件下厭氧培養48 h。根據國標GB 4789 34—2016[15]附錄B 中規定處理菌液，制備乙酸和乳酸提取物，進行液相色譜測定。液相色譜條件：色譜柱，ZorbaxSb-Aq 液相色譜柱 （4.6×150 mm，5 μm）或其他等效色譜柱；流動相：20 mmol/L 的磷酸二氫鈉溶液（pH 值2.0）-乙腈（99+1），等度洗脫，流速1 mL/min；柱溫箱：35 ℃；紫外檢測波長：210 nm；外標定量。計算有機酸代謝產物乙酸與乳酸微摩爾之比，比值大于1 即為雙歧桿菌的代謝特性。

1.7 篩選菌株DNA 的PCR 擴增和電泳、16S rDNA菌種鑒定

根據 E.Z.N.A.R soil 試劑盒 （Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行總DNA 抽提，DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000 進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA 提取質量；用27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TAC CTTGTTACGACTT-3')引物對16S 區進行PCR 擴增，擴增程序為：于94 ℃條件下預變性5 min，35 個循環（94 ℃變性 30 s，54 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1.5 min），最后于 72 ℃條件下延伸 10 min（PCR 儀：ABI GeneAmpR9700 型）。擴增體系為 25 μL，引物各 1 μL（27F-1492R），9.5 μL 超純水，12.5 μL Taq PCR Master Mix （2x，blue）[16]。

根據 Illumina MiSeq 平臺 （Illumina，San Diego，USA）標準操作規程，將純化后的擴增片段構建PE 2*300 的文庫。所測序列進行NCBI 文庫的Blast 比對，比對出相似菌株。

1.8 利用16S rDNA 鑒定腸道菌群分離雙歧桿菌時X-Gal 顯色菌群范圍

針對X-Gal 顯色雙歧桿菌BS 培養基所篩選菌株所有顯色純菌株，不經過其他鑒定方法，僅使用16S rDNA 測序的鑒定方法。將擴增序列進行NCBI 文庫的16S rDNA 序列同源性比對，得出在雙歧桿菌分離過程中所有顯色菌株的大致范圍。

2 結果與分析

2.1 采樣液的篩選

3 種采樣液及采樣方式的顯色菌落計數結果（p≤0.05）見表1。

表1 3 種采樣液及采樣方式的顯色菌落計數結果（p≤0.05）

由表1 可看出，使用雙歧桿菌BS 培養基作為采樣液時顯色菌落計數量普遍最高，培養基中L-半胱氨酸鹽為雙歧桿菌的生長提供更適宜其生長的還原性環境，能夠更有效地保存糞便中的X-Gal 顯色菌群，為后續雙歧桿菌的分離培養提供分離基礎和菌群環境；對比25%甘油溶液是3 種中最差的糞便顯色菌群保持溶液，生理鹽水與雙歧桿菌BS 培養液計數結果較為接近且有一定差距。兩者可以保存腸道菌群中顯色菌群，但效果較差。后期分離出的雙歧桿菌菌株有85%來自于雙歧桿菌BS 培養基作為采樣液的樣品中。

2.2 雙歧桿菌菌株的分離和鑒定結果

研究結果表明，鑒于雙歧桿菌的生長要求的特點，選用X-Gal 與莫匹羅星鋰鹽改良的雙歧桿菌BS培養基，既能抑制其他雜菌的生長，又能有較為明顯的顯色菌落。結果顯示，分離出X-Gal 顯色菌株，長壽老人組共挑選出50 株菌株，嬰兒對照組共挑選出12 株菌株。

過氧化氫酶試驗中，陽性菌株共29 株，陰性菌株共33 株。使用API 50CH 碳水化合物鑒定試劑條、HPLC 有機酸鑒定和16S rDNA 菌種鑒定的方法：百歲組共鑒定篩選出10 株雙歧桿菌菌株，嬰兒對照組共鑒定篩選出5 株雙歧桿菌菌株。

15 株雙歧桿菌菌種的菌落特征與菌落形態見表2。

2.3 顯色菌株16S rDNA 同源性分析與鑒定

將62 株分離的顯色菌株PCR 擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在1500 BP 左右有一條明亮的色帶，滿足測序要求，進行測序，并將測序結果在NCBA 中進行BLAST 比對，尋找數據庫中與目的基因序列同源性最高的菌種，確定目的基因的歸屬[17]。

表2 15 株雙歧桿菌菌種的菌落特征與菌落形態

X-Gal 顯色菌株的16S rDNA 鑒定結果及其同源相似度如圖1 所示，其中百歲老人組中有5 株動物雙歧桿菌 （Bifidobacterium animalis）模式菌株 Bifidobacterium animalis subsp.DSM 10140(T)，3 株兩歧雙歧桿菌 （Bifidobacterium bifidum）模式菌株 Bifidobacterium bifidum BNCC186304，2 株長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）模式菌株 Bifidobacterium longum subsp.Longum JCM 1217；嬰兒對照組中1 株動物雙歧桿菌，2 株兩歧雙歧桿菌，2 株長雙歧桿菌。

其他顯色菌株中，百歲老人組有6 株經過鑒定為唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）與模式菌株BCRC 14759(T)同源相似度性范圍98.93%～99.39%，嬰兒組未出現；百歲老人組有12 株硝化芽孢桿菌（Bacillus nitratireducens）與模式菌株 4049(T)相似度范圍為98.6-99%，嬰兒組未出現；百歲老人組有5 株鑒定為加氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）與模式菌株ATCC 33323(T)相似度范圍為98.93%～99.05%，嬰兒組有2 株；百歲老人組有4 株鑒定為大腸桿菌LFHY_s 與模式菌株B1147 相似度范圍為99.40%～99.76%，嬰兒組未出現；百歲老人組有7 株鑒定為呂氏桿菌（Bacillus luti）與模式菌株TD41(T)相似度范圍為98.91%～98.94%，嬰兒組未出現；嬰兒組有5 株鑒定為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）與模式菌株CECT 562(T)相似度范圍為99.19%～99.75%，百歲老人組未出現；百歲老人組有5 株鑒定為陰道乳桿菌（PNGN_s）與模式菌株UMB0388 相似度范圍為99.19%～99.75%，嬰兒組未出現。

從長壽老人分離出的X-Gal 顯色菌落種類比較繁雜且分散于各種桿菌及乳桿菌等，分離出的雙歧桿菌菌株數較少，占總菌株數的24%；嬰兒分離出的雙歧桿菌比例較高，占42%，且顯色菌株多為乳桿菌。由此可知雙歧桿菌在嬰兒腸道定殖的比例高于長壽老人，且分離較為容易。

X-Gal 顯色菌株的16Sr DNA 鑒定結果見圖1。

3 結論

雙歧桿菌對生長條件的要求較為嚴苛，從多菌混樣中分離雙歧桿菌尚且不易，從人類糞便中更為困難。篩選3 種糞便樣品采樣液，使用雙歧桿菌BS培養基作為采樣液可以更有助于雙歧桿菌的分離。在X-Gal 作為指示劑進行雙歧桿菌分離時，從河南洛陽百歲老人糞便中分離出能夠顯藍色的共50 株菌株，而對照組嬰兒組分離出12 株顯藍色菌株。其中，百歲老人組共有10 株鑒定為雙歧桿菌，嬰兒組共有5 株鑒定為雙歧桿菌，其所占比例分別為24%和42%。由此說明，百歲老人腸道中的雙歧桿菌分離相較于嬰兒更為困難。

圖1 X-Gal 顯色菌株的16Sr DNA 鑒定結果

X-Gal 在雙歧桿菌的分離中不能作為該菌屬的特異性指示劑，微生物只要能分泌出分解該指示劑的酶就能在分離時使菌落周圍呈現藍色。經過16S rDNA 菌種鑒定顯示，在糞便雙歧桿菌分離鑒定中顯示藍色的菌種大致是：唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）、硝化芽孢桿菌 （Bacillus nitratireducens）、加氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）、大腸桿菌LFHY_s、呂氏桿菌（Bacillus luti）、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），以及大多數的雙歧桿菌菌種。因此，以上菌種都能分泌β-半乳糖苷酶，從而分解X-Gal，使菌落周圍顯現藍色。

通過研究發現，在糞便中分離雙歧桿菌時，X-Gal 并不是唯一指示劑，研究結果給出了使用X-Gal 作為指示劑時顯色菌落的大致菌種，且百歲老人的腸道菌群相較于嬰兒更難分離。試驗為后人提供更為清晰的腸道中雙歧桿菌的分離步驟和方法，也為X-Gal 應用與腸道菌分離提供參考。