基于氧化應激探索木犀草素對缺氧-復氧損害的H9c2心肌細胞的保護作用

劉琳

作者單位：青海省心腦血管病?？漆t院冠心病科，青海 西寧810000

缺血性心臟病是由冠狀動脈循環功能或者器質性的改變所導致的冠狀動脈血流和心肌細胞需氧量之間失調而引起的心肌損傷［1］，其中冠狀動脈粥樣硬化引起的冠狀動脈狹窄和閉塞是最常見的因素［2］。因此，緩解心肌缺血是目前臨床上最為有效的治療手段，但是會出現缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［3］。I/R損傷涉及鈣超載、氧化應激、細胞凋亡等多種機制［4］，其中占主要作用的是氧化應激損傷。因此，研究者們在臨床和基礎實驗中針對I/R損傷的氧化應激機制，做了大量研究，發現可通過使用具有抗氧化功效的藥物可以降低I/R損傷的發生概率，這些藥物包括白藜蘆醇、茶多酚、人參皂苷、東莨菪堿和維生素C、輔酶Q等［5］。木犀草素作為黃酮類化合物，具有多酚結構，存在于多種植物中，研究發現具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎等作用。已有研究發現木犀草素對糖尿病小鼠心肌損傷［6］、高糖誘導的心肌微血管內皮細胞損傷［7］、腦缺血再灌注損傷［8］等均具有明顯的改善效果，而木犀草素對心肌缺血再灌注損傷的研究相對較少，其中姚紅等人研究發現木犀草素對心肌細胞損傷具有保護作用［9］，但未從缺血再灌注和氧化應激層面去闡釋保護機制。因此，本研究于2017年1月至2018年6月通過體外構建H9c2心肌細胞缺氧-復氧損傷的模型，探討木犀草素對構建的模型細胞株氧化應激的影響及其作用機制，為木犀草素在臨床上應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料木犀草素（72511）購于美國Sigma公司。H9c2心肌細胞（大鼠胚胎）購于中科院上海細胞庫。H-DMEM培養基購買于美國Gibco公司，胎牛血清（FBS）購于四季青公司，總谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（A061-1）購于南京建成生物工程研究所，丙二醛（MDA）檢測試劑盒（S0131）、RIPA 裂解液（P0013C）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠二抗（A0216）及HRP標記山羊抗兔二抗（A0208）購于上海碧云天生物技術有限公司，實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（RR820A）、Trizol試劑（9109）、反轉錄PCR試劑盒（RR047A）購于寶生物工程（大連）有限公司，鼠抗Kelch樣ECH關聯蛋白1（Keap1）單克隆抗體（ab150654）、兔抗核因子E2相關因子2（Nrf2）單克隆抗體（ab62352，Abcam）購買自Abcam公司，8-羥基脫氧尿苷（8-OHdG）酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，ml002198）。

1.2方法

1.2.1H9c2心肌細胞缺氧-復氧損傷造模的構建及分組 模型的制備參照文獻［10］的方法操作：對照組細胞的培養條件是培養箱中二氧化碳的含量為5%，溫度為37℃；模型組細胞則先用含2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose）10，4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）5，氯化鉀（KCl）12，氯化鎂（MgCl2）0.5，氯化鈉（NaCl）139，氯化鈣（CaCl2）1.3，乳酸20，且PH值為6.2的培養液（mmol/L）進行培養，溫度控制在37℃，且培養箱中通入100%氮氣（氧氣＜1%），培養持續8 h后，更換為DMEM培養基（10%FBS），恢復正常的氧氣濃度，繼續培養24 h；木犀草素處理組的細胞分別用5 μM、10 μM、20 μM的木犀草素［母液溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，DMSO終濃度為0.5%］預處理24 h，隨后進行上述缺氧-復氧實驗；對照組和缺氧-復氧組均加入終濃度為0.5%的DMSO。

1.2.2MTT檢測木犀草素對缺氧-復氧損傷的H9c2的影響 利用胰酶消化處在對數生長期H9c2心肌細胞，制備成單細胞懸液，按照每孔4×105個細胞接種于6孔板中和每孔1.5×104個細胞接種于96孔板中，貼壁后，參考1.2.1項，利用木犀草素進行處理及缺氧-復氧損傷，處理結束，用倒置顯微鏡觀察6孔板中細胞形態的改變；加5 mg/mL的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）20 μL到96孔板的細胞中，正常環境培養4 h，棄去上清，加入150 μL DMSO室溫溶解MTT，于490 nm處在酶標儀上測量光密度（OD）值，并計算各組細胞的增殖率。計算公式為：增殖率（%）＝（OD實驗組/OD對照組）×100%。

1.2.3流式細胞術檢測木犀草素對缺氧-復氧損傷的H9c2心肌細胞凋亡的影響 按照1.2.1項的操作對各組細胞進行處理，處理結束后，分別收集各組細胞，用預冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進行洗滌，按照1×106/mL的細胞密度用1×結合緩沖液（Binding Buffer）重懸細胞，在離心管中加入100 μL的重懸細胞，然后分別加入5 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（AnnexinⅤ-FITC）及5 μL碘化丙啶（PI），混勻后，置于25℃避光的條件下孵育15 min，再加入400 μL的1×Binding Buffer，混勻后，用流式細胞儀檢測（此步驟需在1 h內進行）。

1.2.4蛋白質印跡法（Western Blot）檢測木犀草素對缺氧-復氧損傷的H9c2細胞中B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、Keap1、Nrf2蛋白含量的影響 按照1.2.1項下處理各組細胞后，利用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）定量后，加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min，-20℃保存。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），具體流程為蛋白上樣電泳、條帶轉膜、封閉背景、加入一抗進行孵育、加入二抗孵育、利用ECL發光液顯色、然后自動曝光儀曝光，最后對條帶進行拍照分析。

1.2.5qPCR檢測木犀草素對缺氧-復氧損傷的H9c2細胞中MDA、8-OHdG、GSH含量的影響 按照1.2.1項的步驟對各組細胞進行處理后，在PBS緩沖液中研碎細胞，然后離心取上清棄雜質，按照試劑盒說明書中的檢測步驟對上清中MDA、8-OHdG、GSH含量進行檢測，其中TBA法檢測MDA、ELISA檢測8-OHdG，微量酶標法檢測GSH。

1.2.6木犀草素對缺氧-復氧損傷的H9c2細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）、血紅素加氧酶（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶（NQO1）mRNA表達影響按照1.2.1項的步驟處理各組細胞后，利用Trizol法提取細胞總RNA，并用用RNase-free水溶解，按照反轉錄PCR試劑盒說明書合成cDNA，再按照qPCR試劑盒的步驟進行qPCR，熒光定量反應程序為：預變性：95℃、10 min、1循環數；擴增：95℃、15 s，60℃、15 s，72 ℃、30 s、40循環數。用2-△△Ct表示基因相對表達量。引物序列如表1所示。

1.3統計學方法采用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行統計，以±s表示計量資料，采用單因素方差分析進行多組間比較，采用LSD-t檢驗進行多組間的兩兩比較，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1木犀草素對缺氧-復氧損傷H9c2細胞的影響如圖1所示，兩組細胞的形態變化：對照組的細胞生長狀態良好，大部分呈梭形；而缺氧-復氧損傷的細胞大部分呈現不規則多角形，且懸浮、裂解、細胞碎片明顯增多，細胞內出現細微顆粒物，表面粗糙，增殖率顯著下降［對照組：（100±0）%比缺氧-復氧組：（19.73±3.56）%，t＝39.054，P＝0.000］；經木犀草素處理后，再進行缺氧-復氧損傷，發現隨著增加木犀草素的濃度，不規則細胞的數量，細胞中懸浮、裂解、細胞碎片均逐漸下降，增殖率逐漸增加，與缺氧-復氧損傷組相比，差異有統計學意義［缺氧-復氧組：（19.73±3.56）%比5 μM木犀草素組：（39.45±4.38）%、10 μM木犀草素組：（66.11±5.69）%、20 μM木犀草素組：（94.38±10.18）%，t1＝3.304，P＝0.027；t2＝6.831，P＝0.002；t3＝11.989，P＝0.000］（F＝12.486，P＝0.000）。

2.2木犀草素對缺氧-復氧損傷H9c2心肌細胞凋亡的影響如圖2所示，相比對照組細胞凋亡率（8.14±1.13）%，缺氧-復氧組細胞中早晚期凋亡細胞的比例明顯上升（72.37±6.98）%，差異有統計學意義（t＝15.733，P＝0.000）；經木犀草素處理后，再進行缺氧-復氧損傷，發現與缺氧-復氧組細胞凋亡相比，隨木犀草素濃度的增加，實驗組早晚期細胞凋亡比例逐漸減少［（65.45±5.14）%、（41.38±4.32）%、（29.67±5.67）%］，其中10 μM和20 μM木犀草素組細胞凋亡顯著減少（t1＝6.539，P＝0.003；t2＝8.224，P＝0.001）（F＝8.863，P＝0.000）。

2.3木犀草素對缺氧-復氧損傷的H9c2細胞中Bax、Bcl-2蛋白含量的影響如圖3所示，相比對照組，缺氧-復氧組細胞中Bax蛋白表達量增加顯著（t＝11.079，P＝0.000），Bcl-2蛋白含量顯著減少（t＝9.608，P＝0.001）；經木犀草素處理后，再進行缺氧-復氧損傷，發現與缺氧-復氧組細胞相比，隨木犀草素濃度的增加，實驗組細胞中Bax蛋白含量逐漸下降，而Bcl-2蛋白含量則逐漸上升，其中10 μM和20μM木犀草素處理組中的細胞Bax和Bcl-2蛋白變化均差異有統計學意義（Bax：t1＝4.979，P＝0.008；t2＝10.224，P＝0.001；Bcl-2：t1＝6.124，P＝0.004；t2＝8.386，P＝0.001）。見表2。

表2 木犀草素對H9c2細胞中B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）蛋白含量的半定量統計/±s

表2 木犀草素對H9c2細胞中B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）蛋白含量的半定量統計/±s

注：與對照組相比，aP＜0.05；與缺氧-復氧組相比，bP＜0.05

組別對照組缺氧-復氧組5 μM木犀草素組10 μM木犀草素組20 μM木犀草素組F值P值Bax相對表達量0.38±0.04 1.01±0.09a 0.83±0.05 0.71±0.06b 0.45±0.03b 11.346 0.000重復次數3 3 3 3 3 Bcl-2相對表達量0.83±0.06 0.43±0.04a 0.47±0.05 0.63±0.04b 0.74±0.05b 8.674 0.000

2.4木犀草素對缺氧-復氧損傷的H9c2細胞中MDA、8-OHdG、GSH含量的影響如表3所示，相比對照組，MDA、8-OHdG含量在缺氧-復氧組細胞中顯著增加（MDA：t＝17.054，P＝0.000；8-OHdG：t＝7.691，P＝0.002），GSH含量顯著減少（t＝12.389，P＝0.000）；經木犀草素處理后，再進行缺氧-復氧損傷，發現與缺氧-復氧組細胞相比，隨木犀草素濃度的增加，實驗組細胞中MDA、8-OHdG含量逐漸減少，GSH含量逐漸增加，其中5 μM、10 μM和20 μM木犀草素組細胞中MDA、8-OHdG和10 μM和20 μM木犀草素組細胞中GSH含量變化均差異有統計學意義（MDA：t1＝5.879，P＝0.004；t2＝11.748，P＝0.000；t3＝15.062，P＝0.000；8-OHdG：t1＝3.778，P＝0.019；t2＝6.054，P＝0.004；t3＝7.850，P＝0.001；GSH：t1＝6.326，P＝0.003；t2＝8.395，P＝0.001）。

表3 木犀草素對H9c2細胞中丙二醛（MDA）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、谷胱甘肽（GSH）含量的影響/±s

表3 木犀草素對H9c2細胞中丙二醛（MDA）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、谷胱甘肽（GSH）含量的影響/±s

注：與對照組相比，aP＜0.05；與缺氧-復氧組相比，bP＜0.05

重復次數33333組別對照組缺氧-復氧組5 μM木犀草素組10 μM木犀草素組20 μM木犀草素組F值P值MDA/（nmol/mg）0.45±0.05 1.73±0.12a 1.12±0.11b 0.82±0.06b 0.63±0.04b 6.789 0.001 8-OHdG/（ng/L）183.81±20.68 316.37±21.53a 253.26±19.33b 211.45±20.98b 189.15±18.01b 14.342 0.000 GSH/（nmol/mg）193.98±12.38 88.59±7.99a 107.96±15.66 142.19±12.31b 178.67±16.78b 7.658 0.001

2.5木犀草素對缺氧-復氧損傷的H9c2細胞中γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA表達的影響如圖4所示，相比對照組，γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA在缺氧-復氧組細胞中表達量均顯著下降（γ-GCS：t＝8.165，P＝0.001；HO-1：t＝40.836，P＝0.000；NQO1：t＝21.218，P＝0.000）；經木犀草素處理后，再進行缺氧-復氧損傷，發現與缺氧-復氧組細胞相比，隨木犀草素濃度的增加，實驗組細胞中γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA表達逐漸增加，其中10 μM和20 μM木犀草素組細胞中γ-GCS以及5 μM、10 μM和20 μM木犀草素組細胞中HO-1、NQO1 mRNA變化均差異有統計學意義（γ-GCS：t1＝3.149，P＝0.035；t2＝4.649，P＝0.010；HO-1：t1＝5.945，P＝0.004；t2＝9.624，P＝0.001；t3＝9.126，P＝0.001；NQO1：t1＝5.284，P＝0.006；t2＝6.003，P＝0.004；t3＝8.764，P＝0.001）。見表4。

表4 木犀草素對H9c2細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）、血紅素加氧酶（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶（NQO1）mRNA表達影響/±s

表4 木犀草素對H9c2細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）、血紅素加氧酶（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶（NQO1）mRNA表達影響/±s

注：與對照組相比，aP＜0.05；與缺氧-復氧組相比，bP＜0.05

組別對照組缺氧-復氧組5 μM木犀草素組10 μM木犀草素組20 μM木犀草素組F值P值NQO1 mRNA 1.00±0.00 0.51±0.04a 0.73±0.06b 0.82±0.08b 1.15±0.12b 7.322 0.000重復次數33333 γ-GCS mRNA 1.00±0.00 0.67±0.07a 0.73±0.08b 0.85±0.07b 1.02±0.11b 3.243 0.003 HO-1 mRNA 1.00±0.00 0.41±0.03a 0.63±0.06b 0.82±0.07b 0.95±0.10b 5.786 0.002

2.6木犀草素對缺氧-復氧損傷的H9c2細胞中Keap1、Nrf2蛋白含量的影響如圖5所示，與對照組相比，缺氧-復氧組細胞中Keap1蛋白含量有所減少（t＝2.976，P＝0.04），Nrf2蛋白含量有所升高（t＝5.644，P＝0.005）；經木犀草素處理后，再進行缺氧-復氧損傷，發現與缺氧-復氧組細胞相比，隨木犀草素濃度的增加，實驗組細胞中Keap1蛋白含量逐漸更加減少，Nrf2蛋白含量逐漸更加升高，其中10μM和20μM木犀草素組細胞中Keap1和Nrf2蛋白變化均差異有統計學意義（Keap1：t1＝17.041，P＝0.000；t2＝23.945，P＝0.000；Nrf2：t1＝4.631，P＝0.010；t2＝6.426，P＝0.003）。見表5。

圖5 木犀草素對H9c2細胞中核因子E2相關因子2（Nrf2）、Kelch樣ECH關聯蛋白1（Keap1）蛋白含量的影響（蛋白質印跡法條帶）

表5 木犀草素對H9c2細胞中核因子E2相關因子2（Nrf2）、Kelch樣ECH關聯蛋白1（Keap1）蛋白含量的半定量統計/± s

表5 木犀草素對H9c2細胞中核因子E2相關因子2（Nrf2）、Kelch樣ECH關聯蛋白1（Keap1）蛋白含量的半定量統計/± s

注：與對照組相比，aP＜0.05；與缺氧-復氧組相比，bP＜0.05

組別對照組缺氧-復氧組5 μM木犀草素組10 μM木犀草素組20 μM木犀草素組F值P值Keap1相對表達量0.83±0.045 0.72±0.04a 0.61±0.05 0.28±0.02b 0.15±0.01b 5.634 0.003重復次數33333 Nrf2相對表達量0.43±0.031 0.62±0.05a 0.73±0.045 0.85±0.07b 0.97±0.08b 4.333 0.002

3 討論

缺血再灌注可引起心肌損傷，主要原因在于缺氧-復氧引起的氧化應激與線粒體代謝障礙之間的協同作用導致心肌發生炎癥、心肌細胞凋亡［11-12］。目前抗氧化藥物的應用在基礎和臨床研究中表現出對缺血再灌注心肌損傷良好的保護效果。木犀草素是天然的抗氧化劑，可利用這一特點對多種疾病的預防及發生發展起到保護作用［13-16］。因此，本研究在體外缺氧-復氧培養H9c2心肌細胞模擬缺血再灌注，通過檢測直接缺氧-復氧培養和先木犀草素再缺氧-復氧培養的H9c2細胞的損傷凋亡情況及其氧化應激水平的變化，進一步在氧化應激損傷心肌細胞的層面探索了木犀草素對缺血再灌注損害的心肌細胞的保護作用。

心肌細胞凋亡是缺血再灌注對心肌細胞最直觀和最終的損傷。缺血再灌注引起的種種代謝變化最后都會引起心肌細胞的凋亡進而導致心肌損傷。細胞核內的凋亡基因Bcl-2/Bax、Bcl-xL、Fas/Fas-L等在缺血缺氧的刺激下進行高表達，迅速啟動細胞凋亡程序，加重細胞的凋亡［17-18］。有研究顯示，細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷的發生過程中會損傷心肌細胞的結構與功能損害，因此可用于部分藥物干預治療心肌缺血再灌注損傷的靶點［19-20］。在本研究中，我們發現在缺氧-復氧心肌細胞中Bax蛋白的表達量的降低和Bcl-2蛋的白表達量的增加對木犀草素具有濃度依賴性，因此木犀草素可抑制缺氧-復氧造成的心肌細胞凋亡，而在心肌細胞形態觀察和流式檢測的結果中均直觀證實這一抑制凋亡的作用。研究表明，缺血期間心肌細胞內氧自由基大量增加和鈣離子超載是缺血的心肌再灌注后啟動凋亡程序的原因［21-22］，首先細胞膜中的不飽和脂肪酸被大量增加的氧自由基攻擊，引起細胞膜脂質過氧化及膜脂質微環境的改變，因此引發細胞膜功能和結構的障礙，細胞膜通透性增加，流動性降低，進而損傷整個細胞的結構和功能，最終導致細胞的凋亡；其次細胞內的核糖核酸也會被氧自由基氧化損傷，導致細胞的凋亡。在實驗中MDA和8-OHdG分別作為脂質過氧化和DNA過氧化的標志物，在本研究中顯示木犀草素可以抑制因缺氧-復氧引起胞中MDA和8-OHdG濃度，這一抑制作用具有濃度依賴性，提示木犀草素可保護缺氧-復氧心肌細胞中脂質和DNA免受過氧化損傷。

在正常心肌細胞內存在整套抗氧自由基酶系統和天然抗氧化劑，可使體內產生的氧自由基被不斷消除，并維持在低水平狀態，使心肌細胞免受損害。過氧化氫酶（CAT）、血紅素氧合酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、人醌氧化還原酶1（NQO-1）谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、等都屬于抗氧自由基酶，輔酶Q10、VitC、VitE、VitA、谷胱甘肽（GSH）等屬于天然抗氧化劑。在發生急性心肌缺血時，體內常規消除氧自由基的酶活性受到了抑制，在進行再灌注時，有大量酶被帶走，因此不能正常發揮清除作用，導致氧自由基含量增加。本研究結果顯示，在由缺氧-復氧損傷心肌細胞中，木犀草素可濃度依賴的提高胞中降低的GSH含量以及增加γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA的表達量，說明木犀草素可有效地改善心肌細胞內抗氧化系統，進而保護心肌細胞免受缺氧-復氧造成的過氧化損傷。

近年研究發現，細胞內抗氧化應激發揮關鍵作用的通路是Nrf2-抗氧化響應元件（ARE）信號通路，其可以通過調控細胞抗氧化酶系和Ⅱ相解毒酶清除氧自由基等有害物質，發揮中和解讀的作用［23］。在激活Nrf2-ARE信號通路后，可誘導大量保護性基因NQO1、HO-1、γ-GCS等進行轉錄，抵御外界刺激對機體產生的氧化應激損傷［24］。在正常狀況下，Keap1與Nrf2相結合，促進Nrf2泛素化降解，抑制Nrf2進核。在氧化應激狀態下Keap1與Nrf2解離，Nrf2激活進入細胞核，啟動下游Ⅱ相解毒酶等一系列保護性基因的轉錄和蛋白表達，增強細胞的抗氧化能力［25］。本研究發現缺氧-復氧可是減少心肌細胞內Keap1蛋白含量，增加Nrf2蛋白的含量，說明Nrf2-ARE信號通路被氧化應激激活，同時木犀草素可濃度依賴的降低心肌細胞內Keap1蛋白的含量，增加Nrf2蛋白的含量，這說明在缺氧-復氧損傷的心肌細胞中，木犀草素可激活Nrf2-ARE信號通路來保護心肌細胞。

綜上所述，木犀草素可抑制由缺氧-復氧導致的心肌細胞凋亡，保護心肌細胞免受缺氧-復氧損傷。一方面木犀草素通過激活細胞內抗氧化應激的關鍵信號通過Nrf2-ARE通路，促進細胞內抗氧自由基酶的表達，降低損傷細胞的氧化應激水平，保護缺氧-復氧損傷的心肌細胞。但是本研究僅局限于木犀草素的抗氧化性，探索其在氧化應激水平的分子機制，而木犀草素的其他藥理特性是否參與保護心肌細胞免受缺氧-復氧損傷還未可知，需后續進行研究。

（本文圖1～4見插圖6-2）

圖1 木犀草素對缺氧-復氧損傷的H9c2的影響（×100）:A為對照組；B為缺氧-復氧組；C為5 μM木犀草素組；D為10 μM木犀草素組；E為20 μM木犀草素組

圖2 木犀草素對H9c2細胞凋亡的影響：A為對照組；B為缺氧-復氧組；C為5 μM木犀草素組；D為10 μM木犀草素組；E為20 μM木犀草素組

圖3 木犀草素對H9c2細胞中B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）蛋白含量的影響（蛋白質印跡法條帶）

圖4 木犀草素對H9c2細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（圖4A）、血紅素加氧酶（圖4B）、NAD（P）H醌氧化還原酶（圖4C）mRNA表達影響（溶解曲線圖）