腫瘤患者圍手術期自異體輸血對輸血相關免疫調節效應影響的比較

黃晶， 付佳

（1.孝感市中心醫院檢驗科，湖北 孝感 432000；2.沈陽醫學院基礎醫學院）

異體輸血是圍手術期治療的重要手段［1］。然而，異體輸血引起機體多種不良反應的問題也受到越來越多的關注［2］。以往對輸血副作用的認識多局限在溶血性輸血反應和疾病傳播，而對輸血造成的免疫抑制作用認識不足［3］。有研究結果表明，血液作為一種免疫原性和反應原性物質，在輸血過程中會伴隨產生一系列涉及免疫調節的副反應，稱之為輸血相關免疫調節效應 （transfusion-relelated immunomodulation， TRIM）［4］。 異體輸血對受血者機體免疫系統的抑制作用是相當廣泛的，涉及體內多種免疫細胞數量及其功能、淋巴細胞不同亞群之間的比例失調、各類免疫球蛋白含量變化、細胞因子濃度消長、補體系統分子濃度變化等多方面的改變［5］。然而，對于腫瘤患者而言，免疫功能的變化是腫瘤患者在術后能否徹底清除腫瘤細胞的關鍵因素。因此有學者根據臨床研究結果，提出了輸血可能導致腫瘤手術后癌腫復發率增高、增加死亡風險的假說［6］，并且得到隨后進一步研究的證實［7］。與異體輸血比較，圍手術期自體輸血方法不僅在避免疾病傳播、溶血性輸血反應、發熱及過敏、移植物抗宿主反應等方面明顯優于對照，而且能夠明顯降低或消除輸血對患者免疫功能的抑制作用［2］。因此，探討圍手術期異體輸血與自體輸血對患者免疫系統的影響意義重大。

本研究通過對我院圍手術期需要輸血的婦科惡性腫瘤患者進行等容稀釋自體輸血和異體輸血，然后測量不同時段外周血中免疫物質含量的變化，分析兩種輸血方式對腫瘤患者T淋巴細胞及其亞群、細胞因子的變化，為腫瘤患者圍手術期選擇合理輸血方式、科學地分析其對腫瘤患者術后免疫狀態的影響提供必要的理論依據和臨床研究資料。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年12月至2019年4月孝感市中心醫院收治的實施婦科惡性腫瘤根治術的患者60例為研究對象，將患者隨機分為觀察組和對照組，各30例，其中觀察組采用等容稀釋自體輸血，對照組采用異體輸血。納入標準：患者在手術前3個月內均無輸血史，且術前及術后30 d內均未予放、化療和免疫治療。所有患者術前血紅蛋白＞120 g／L，紅細胞比容＞35%。排除標準：內分泌及免疫性疾病者；血源性傳染病者。2組患者的年齡、術中出血量、輸血量、手術時間、腫瘤類型及術式差異均無統計學意義 （P＞0.05），見表1。2組患者均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會批準。

表1 2組患者一般資料及手術概況比較 （±s）

表1 2組患者一般資料及手術概況比較 （±s）

組別 n 年齡 （歲） 失血量 （ml） 輸血量 （ml） 手術時間 （min） 腫瘤類型 術式對照組 30 65.36±4.87 273±91 400±50 194±40 惡性 根治術觀察組 30 65.41±4.69 276±95 400±50 196±42 惡性 根治術

1.2 方法 2組患者手術均采用靜脈復合麻醉。觀察組患者，麻醉后術前經橈動脈采血400～600 ml，同時經靜脈輸入相當容量的羥乙基淀粉，術中根據情況將自身血回輸。對照組患者，輸異體全血400～600 ml。2組患者均在術前，以及術后第1天、第7天分別取外周靜脈血4 ml／次，每2 ml置于1個EDTA-K2抗凝試管中，共2管，即刻送到檢驗科 （注：用于測定T淋巴細胞亞群的抗凝血無需離心，4℃冷藏備用，使用前充分混勻；用于測定細胞因子的抗凝血，3 000 r／min離心30 min取上清，-80℃凍存，備用）。

1.2.1 流式細胞儀檢測T淋巴細胞 （1）免疫熒光標記T淋巴細胞?；靹蚯笆隼洳貍溆玫目鼓?，加100μl全血于試管中，分別加入抗人CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP以及 CD4-APC單克隆熒光抗體各20μl，用振蕩器充分混勻后，4℃，避光孵育20 min，4℃保存備用。（2）流式細胞儀檢測分析 （儀器型號及配套試劑生產廠家：美國BD公司FACSCalibur，試劑：美國BD公司淋巴細胞亞群檢測試劑盒）。檢測前，流式細胞儀采用BD Calibrite標準熒光微球，按照FACSComp程序，校準熒光通道FL1（標記物—FITC異硫氰酸熒光素）、FL2（標記物—PE藻紅蛋白）、FL3（標記物—PerCP多甲藻黃素）、FL4（標記物—APC別藻藍蛋白）及側向散射光（SSC）、前向散射光 （FSC）通道的準確性。上述染色后細胞，用BD Lysing solution溶血素破壞紅細胞后，上機運行和獲取≥10 000的顆粒事件。利用含已知數量標準微球的絕對計數管進行絕對計數，結果用雙參數散點圖表示。

1.2.2 細胞因子檢測 采用ELISA方法通過酶標儀對血清中的細胞因子 （IL-2、IL-10、IFN-γ）進行檢測分析 （儀器及配套試劑生產廠家：奧地利貝利公司，型號：BL Ecsys）。（1）酶標孔板為48孔，設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μl；（2）樣本孔先加待測樣本10μl， 再加樣本稀釋液40μl； 空白孔不加。 （3）除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶 （HRP）標記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。（4）棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次 （也可用洗板機洗板）。（5）每孔加入底物 A、B各 50μl，37℃避光孵育 15 min。 （6） 每孔加入終止液50μl，15 min內， 通過酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值。（7）通過酶標儀繪制標準曲線：以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。其中IL-2的參考值為15～100 pg／ml， IL-10的參考值為＜5 pg／ml， IFN-γ 的參考值為 15～200 pg／ml。

1.3 統計學方法 采用SPSS 11.5軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示，采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者T細胞及各T細胞亞群構成比的變化情況比較 其中1例患者雙參數散點圖舉例見圖 1。 術后第 1天，2組患者的 CD3＋、CD4＋、CD8＋細胞數占T細胞百分比與術前相比均顯著減少 （P＜0.05）； 術后第7天， 對照組患者的CD3＋、CD4＋、CD8＋細胞 （外周血中極少存在雙陽性T細胞）所占百分比顯著少于同組術前 （P＜0.05），觀察組與同組術前比較差異無統計學意義 （P＞0.05）； 觀察組患者 CD3＋、 CD4＋、 CD8＋細胞數在T細胞中所占百分比明顯高于對照組 （P＜0.05），見表2。

表2 2組患者T淋巴細胞亞群占比的變化情況 （±s，%）

表2 2組患者T淋巴細胞亞群占比的變化情況 （±s，%）

注：與同組術前比較，1）P＜0.05；與對照組比較，2）P＜0.05。CD3＋、CD4＋、CD8＋細胞所代表的數值是各細胞占T細胞的百分比

時間 組別 n CD3＋ CD4＋ CD8＋術前 對照組 30 65.1±4.1 58.2±5.3 31.7±4.7觀察組 30 67.2±5.1 59.9±4.8 32.4±4.3術后第1天 對照組 30 52.1±5.4 1） 50.7± 3.91） 23.7±4.31）觀察組 30 62.7±5.3 1） 52.7±5.1 1） 27.1±3.9 1）術后第7天 對照組 30 51.7±4.51） 46.0±5.21） 22.4±4.21）觀察組 30 65.1±4.72） 57.4±4.92） 30.4±4.62）

2.2 2組患者細胞因子的變化情況 術后第1天，觀察組患者IL-2、IFN-γ水平，對照組患者IL-10水平較本組術前顯著升高 （P＜0.05）；對照組患者IL-2、IFN-γ水平，觀察組患者IL-10與本組術前比較，差異均無統計學意義 （P＞0.05）。術后第7天，觀察組患者細胞因子水平與術前比較，差異均無統計學意義 （P＞0.05），對照組患者IL-2、IFN-γ水平較術前顯著減少，IL-10水平較術前顯著增加 （P＜0.05）； 觀察組患者的IL-2、IFN-γ水平顯著高于對照組患者 （P＜0.05），2組IL-10水平比較差異無統計學意義。見表3。

3 討論

免疫功能高低對于腫瘤患者的預后十分重要，異體輸血可能使被輸血的腫瘤患者免疫功能受到抑制，增加患者術后腫瘤復發率，使其存活時間縮短［8］。

T細胞亞群在腫瘤免疫監視中起重要作用，對判斷腫瘤的發展及預后轉歸有著重要意義。本研究結果顯示術后第7天對照組CD3＋、CD4＋、CD8＋比觀察組顯著下降，提示術后機體免疫狀況下降，可能是因為異體輸血導致機體免疫力受到抑制。蘭炯采等［9］研究發現可溶性HLA-類抗原分子和Fas配體存在于同種異體血的血清中，它們可以結合相應的配體，通過封閉受體和誘導凋亡來抑制T細胞功能。

IL-2具有活化T細胞，促進細胞因子產生，增強NK細胞活性，促進B細胞增殖分化，激活巨噬細胞的功能；IFN-γ可以抑制腫瘤細胞的增殖，它們活性的增高有利于抑制和排除細菌，增強患者術后抗感染能力及傷口愈合能力。本研究結果顯示術后第1天，觀察組IL-2和IFN-γ顯著增高，在術后第7天恢復至正常水平，表明自體輸血對機體免疫抑制影響不明顯。異體血的淋巴細胞可以在受血者體內長期存活，使Th2型淋巴細胞分泌IL-10增多，抑制Th1型細胞分化發育，IL-2、IFN-γ分泌減少［11］。本研究結果顯示術后第1天對照組IL-10顯著上升，但是觀察組患者未見明顯上升；術后第7天，對照組IL-10仍然顯著高于術前，而IL-2、IFN-γ顯著低于術前，可能是因為異體輸血下調被輸血者的免疫反應，造成免疫失衡，免疫反應由細胞免疫向體液免疫偏離，被輸血者抵抗感染能力下降。

圖1 1例惡性腫瘤患者外周血T淋巴細胞及CD4＋、CD8＋亞群分析雙參數散點圖

表3 2組患者圍手術期細胞因子的變化 （±s）

表3 2組患者圍手術期細胞因子的變化 （±s）

?

綜上所述，腫瘤患者圍手術期可采用自體和異體兩種輸血方法，這兩種方法對T淋巴細胞及不同亞群數量及功能變化具有不同的影響，自體輸血對惡性腫瘤患者免疫功能影響較小，異體輸血明顯抑制患者免疫功能。