從JAK-STAT信號通路探討痹證寧對風寒濕痹型類風濕關節炎的作用機制

何東初 張倩

【摘 要】目的：探討痹證寧對風寒濕痹型類風濕關節炎JAK-STAT信號通路的影響及作用機制。方法：將70只Wistar大鼠按照隨機數字表法分為空白對照組，模型對照組，痹證寧低、中、高劑量組（9，18，36 g·kg-1），甲氨蝶呤組（1 mg·kg-1）和中西醫結合組（甲氨蝶呤1 mg·kg-1+痹證寧18 g·kg-1），每組10只。除空白對照組外，其余各組大鼠模擬風寒濕環境，采用Ⅱ型膠原誘導方法制備風寒濕痹型類風濕關節炎大鼠模型，各組大鼠給予相應藥物干預。28 d后，觀察大鼠關節腫脹度、關節滑膜組織白細胞介素-6（IL-6）含量、PIAS3、P-STAT3蛋白和JAK3、STAT3 mRNA表達情況。結果：痹證寧可顯著降低風寒濕痹型類風濕關節炎模型大鼠的關節腫脹度，降低IL-6含量，抑制P-STAT3蛋白、JAK3和STAT3 mRNA過表達，增進PIAS3蛋白表達。結論：痹證寧有抗炎、免疫調節作用，其作用機制可能與抑制JAK-STAT信號通路的過度激活有關。

【關鍵詞】 關節炎，類風濕;痹證寧;風寒濕痹;JAK-STAT信號通路

【ABSTRACT】Objective：To explore the effect of Bizheng Ning（痹證寧）on JAK-STAT signal pathwayin rheumatoid arthritis of wind-cold-dampness bi type and its mechanism.Methods：Seventy Wistar rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，low，medium and high dose Bizheng Ning groups（9，18，36 g·kg-1），a methotrexate group（1 mg·kg-1）and a combination group（1 mg·kg-1 of methotrexate + 18 mg·kg-1 of Bizheng Ning）treated with Chinese and Western medicine.There were10 rats in each group.Except the blank control group，the other groups of rats were used to establish rheumatoid arthritis models of wind-cold-dampness bi type by the method of typeⅡ collagen induction.The rats in each group were given corresponding medicine intervention.After 28 days，the degree of joint swelling，the content of IL-6 in synovium tissue，PIAS3，the expressions of P-STAT3 protein，JAK3 and STAT3 mRNA were observed.Results：Bizheng Ning can significantly reduce the joint swelling and IL-6 content，inhibit the expressions of P-STAT3 protein，JAK3 and STAT3 mRNA，and increase the expression of PIAS3 protein.Conclusion：Bizheng Ning has anti-inflammatory and immunomodulatory effects，whose mechanism may be related to inhibiting the over activation of JAK-STAT signal pathway.

【Keywords】arthritis，rheumatoid;Bizheng Ning（痹證寧）;wind-cold-dampnessbi;JAK-STAT signal pathway

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種因高風險遺傳、環境暴露等多種因素導致關節滑膜炎的自身免疫性疾病，其病變可累及內臟器官結構[1]。目前，臨床治療RA的藥物主要有非甾體抗炎藥（NSAIDs）、改善病情抗風濕藥（DMARDs）、糖皮質激素等，這些藥物雖然能在一定程度上緩解病情，但需要長期服用，并且對患者的血細胞、肝腎功能都有不同程度的損害。隨著疾病研究的深入，各種生物制劑相繼出現，但其價格昂貴，且存在感染等不良反應[2-4]。因此，尋求高效低毒又個體化治療的藥物顯得尤為重要。痹證寧是中國人民解放軍中部戰區總醫院自擬中藥復方，前期臨床試驗已證實本方可改善RA患者臨床癥狀且不良反應少[5]。本研究將觀察痹證寧對RA治療效果并探討其作用機制，現總結如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠70只，雌性，體質量（160±20）g，購于湖北省疾病防疫控制中心實驗動物中心，動物許可證號SCXK（鄂）2015-0018。飼養溫度（23±1）℃，濕度（60±10）%，光照和黑暗各12 h更替，每天補充飼料、飲用水保證正常喂養。

1.2 藥品與試劑 痹證寧方由鹿角膠、制附子、威靈仙、青風藤等中藥組成，藥物購自中國人民解放軍中部戰區總醫院并由其中藥制劑室加工制作;甲氨蝶呤片[上海醫藥（集團）有限公司信誼制藥總廠，生產批號036190302];牛Ⅱ型膠原蛋白（biosharp公司）;弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，生產批號SLBW1457）;白細胞介素-6（IL-6）酶聯免疫吸附檢測試劑盒（武漢科鹿生物科技有限責任公司，生產批號16147145646）;抗P-STAT3抗體（美國CST公司，9145S，生產批號34）;抗PIAS3抗體（美國CST公司，4164S，生產批號2）。

1.3 主要儀器 臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，TGL-16c）;冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發公司，TGL-16）;制冰機（常熟市雪科電器有限公司，IMS-20）;PCR儀（杭州博日科技，基因擴增儀TC-XP）;熒光定量PCR儀（Life technologies，StepOne Real-Time PCR System）;酶標儀（Diatek公司，DR-200Bs）;電泳儀（北京市六一儀器廠，DYY-6C）;掃描儀（Canon，LiDE110）。

2 方 法

2.1 動物分組、模型制備及給藥 將Wistar大鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表法分為7組：空白對照組，模型對照組，痹證寧低、中、高劑量組（9，18，36 g·kg-1），甲氨蝶呤組（1 mg·kg-1）和中西醫結合組（甲氨蝶呤1 mg·kg-1 + 痹證寧18 g·kg-1），每組10只。冰浴環境下將牛Ⅱ型膠原蛋白充分溶解于0.1 mol·L-1的冰醋酸，配成濃度為2 mg·mL-1的溶液。4 ℃放置過夜后與等體積完全弗氏佐劑充分乳化制成1 g·L-1的牛Ⅱ型膠原乳劑，于造模各組大鼠足跖及尾根部多點皮下注射配制好的膠原乳劑0.2 mL。除空白對照組外，將其余各組大鼠模擬風寒濕環境[6]，置于5～7 ℃冷水中，水深2 cm，同時伴以4級風力，每日20 min，持續14 d;首次免疫后第7天再次加強免疫1次，以制備風寒濕痹型RA大鼠動物模型;空白對照組大鼠于相同部位皮下注射等量生理鹽水。造模第15天開始灌胃給藥（記為1 d），空白對照組、模型對照組大鼠給予等體積生理鹽水，痹證寧低、中、高劑量組分別給予相應劑量藥物，每日1次，連續28 d;甲氨蝶呤組每周1次給藥，共4次。

2.2 觀察指標 觀察各組大鼠足趾腫脹情況，從造模第15天開始，采用容積法檢測各組大鼠右后肢容積，每周1次。關節腫脹度計算如下：腫脹度 = （造模前容積-造模后容積）/造模前容積×100%。給藥28 d后，將大鼠處死，浸泡在新潔爾滅消毒液中5 min。于膝關節正中縱向切開皮膚，暴露膝關節，在髕骨上緣橫向切斷上面的肌肉和韌帶，再從髕骨兩側向下分離，然后翻開髕骨，打開膝關節，可以看見髕骨下緣韌帶上附著一層微黃發亮的組織，即滑膜組織，用手術刀將其分離出來。用同樣的方法采集另一側膝關節滑膜組織。分別采用ELISA法檢測滑膜組織中IL-6水平，Western Blot法檢測滑膜中PIAS3、P-STAT3蛋白的表達水平，采用Real time-PCR法對滑膜組織中JAK3、STAT3 mRNA表達水平進行檢測，結果分析采用2-△△CT法。見表1。

2.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，進行單因素方差分析，多組間比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 痹證寧對大鼠關節滑膜組織IL-6含量的影響 模型對照組比空白對照組滑膜組織IL-6含量顯著升高（P < 0.01），提示造模成功;給藥組較模型對照組均有所下降，其中，痹證寧中劑量組、甲氨蝶呤組、中西醫結合組差異有統計學意義

（P < 0.01）;在給藥組中，中西醫結合組的IL-6含量最低，與痹證寧各劑量組比較，差異有統計學意義（P < 0.01）。見表2。

3.2 痹證寧對大鼠關節腫脹度的影響 各模型組大鼠關節腫脹度與空白對照組比較顯著升高（P < 0.01）;與模型對照組比較，甲氨蝶呤組、中西醫結合組自給藥7 d，痹證寧給藥14 d均明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.01）;給藥14 d開始，中西醫結合組抗關節腫脹作用明顯優于其他給藥組（P < 0.01）;痹證寧各劑量組中，至給藥28 d，中劑量組較低，高劑量組顯著降低（P < 0.05）。見表3。

3.3 痹證寧對大鼠關節滑膜P-STAT3、PIAS3蛋白表達的影響 與空白對照組比較，模型對照組、痹證寧各劑量組、甲氨蝶呤組大鼠滑膜組織P-STAT3蛋白表達顯著升高（P < 0.01），而模型對照組PIAS3蛋白表達較空白對照組上升，但差異無統計學意義（P ﹥ 0.05）;與模型對照組比較，痹證寧各劑量組、甲氨蝶呤組和中西醫結合組P-STAT3表達明顯降低（P < 0.01），痹證寧中劑量組、甲氨蝶呤組和中西醫結合組PIAS3表達顯著升高（P < 0.01）。其中，中西醫結合組相較其他給藥組P-STAT3顯著降低、PIAS3表達明顯上升，差異有統計學意義（P < 0.01）;而在痹證寧各劑量組中，痹證寧中劑量組大鼠關節滑膜P-STAT3蛋白表達明顯低于痹證寧低、高劑量組（P < 0.01）。見圖1、表4。

3.4 痹證寧對大鼠關節滑膜JAK3、STAT3 mRNA表達的影響 模型對照組、痹證寧各劑量組和甲氨蝶呤組大鼠滑膜JAK3、STAT3 mRNA表達較空白對照組明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.01）;與模型對照組比較，痹證寧各劑量組、甲氨蝶呤組和中西醫結合組JAK3、STAT3 mRNA表達明顯降低（P < 0.01），而與其他給藥組比較，中西醫結合組JAK3、STAT3 mRNA表達顯著降低（P < 0.01）;痹證寧中劑量組大鼠關節滑膜STAT3 mRNA表達低于痹證寧低、高劑量組（P < 0.01），而在JAK3 mRNA表達上，痹證寧中劑量組明顯低于高劑量組（P < 0.01），與痹證寧低劑量組比較，差異無統計學意義（P ﹥ 0.05）。見表5。

4 討 論

RA屬中醫學“痹證”范疇?！队卓迫槨分小氨哉?，內因肝血不足”，《靈樞·陰陽二十五人》中“血氣皆少……善痹骨痛”提示氣血虧虛、肝腎不足是痹證之內因，《素問·痹論篇》中：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也?！北硎撅L寒濕邪是導致痹證發生的外在因素。故本院自擬痹證寧方，由附子、威靈仙、青風藤、徐長卿、細辛、獨活、生薏苡仁等16味中藥組成，有補益氣血肝腎、風寒濕邪得調的功效。其中，制附子[7]具有消除關節腫脹、改善滑膜組織病理變化等作用;威靈仙總皂苷[8-9]可降低IL-6、IL-17、腫瘤壞死因子-α的含量，抑制P-JAK2、P-STAT3蛋白表達，有抗炎鎮痛、調節免疫的作用;青風藤[10]可降低核轉錄因子κB受體活化因子配體/骨保護素水平，抑制破骨細胞生成，對關節破壞起到抑制作用。

膠原誘導性關節炎（CIA）大鼠模型因其病理改變與RA患者相似度最高，是目前公認的篩選治療RA藥物的理想模型[11]。近年來研究表明，促炎細胞因子經JAK/STAT信號通路激活是RA的發病機制和病程進展中的關鍵事件[12]。JAK-STAT信號通路參與多種疾病的免疫、分化、凋亡和腫瘤形成等過程，是細胞內蛋白質之間的相互作用鏈[13]。細胞因子與其相應的膜受體聯系，JAK沉淀激活，介導STAT的酪氨酸磷酸化形成STAT二聚體，轉移至細胞核與相應DNA結合，并最終調控基因轉錄。其中，IL-6與JAK1、JAK2、TYK2結合，誘導STAT3的激活，其水平的升高與T細胞和單核細胞的STAT3磷酸化水平密切相關。而STAT3失調后，可失去對成纖維樣滑膜細胞凋亡的抑制作用，同時對抗體的產生、T細胞存活也失去調節作用[14-15]。PIAS3是調節STAT3過度激活的抑制因子，通過結合STAT3DNA結合域，與二聚體相互作用阻斷其轉錄，從而抑制細胞因子信號轉導[16]。在淋巴細胞大量表達的JAK3參與介導IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15等多種細胞因子的信號轉導，對調節免疫功能、修復軟骨組織有著重要作用[17-18]。針對JAK3的小分子抑制劑Tofacitinib也已被美國FDA批準上市[12]，因此，JAK-STAT信號通路在RA起病和發展過程中發揮著重要調控作用，特異性阻斷JAK3/STAT3通路成為治療RA的靶點。

本課題主要建立風寒濕痹型CIA大鼠模型，觀察痹證寧對RA活動期關節腫脹度的影響及炎性因子IL-6水平表達情況，滑膜組織中PIAS3、P-STAT3蛋白表達，以及JAK3、STAT3 mRNA表達水平的高低，探討痹證寧治療RA的可能作用靶點。實驗結果顯示，痹證寧各劑量組明顯減輕風寒濕痹型CIA大鼠關節腫脹度，對IL-6含量、P-STAT3蛋白，以及JAK3、STAT3 mRNA的過表達較模型對照組均有抑制作用，PIAS3表達上升。因此，痹證寧可能是通過降低IL-6細胞因子含量，抑制JAK3/STAT3信號通路的過度激活狀態，同時增進PIAS3對STAT3的抑制作用來改善關節破壞，延緩RA病情發展。而痹證寧聯合甲氨蝶呤的療效均優于單一用藥，其對JAK-STAT信號通路中PIAS3、P-STAT3、JAK3、STAT3的作用也強于其他各組，為臨床治療RA提供實驗依據。其中痹證寧中劑量組的作用效果較低、高劑量組顯著，可能與中劑量組血藥濃度較高，藥物吸收更好，相對于高劑量組無胃腸道反應等有關。相關預實驗研究提示中劑量療效好，故而選取痹證寧中劑量聯合甲氨蝶呤用藥，下一步可繼續研究痹證寧最佳劑量以及聯合用藥配比關系。

綜上所述，本研究在前期臨床觀察基礎上探討痹證寧對RA的JAK-STAT信號通路的影響。結果表明，痹證寧有抗炎、免疫調節作用，其作用機制可能與抑制JAK-STAT信號通路的過度激活有關?？煽紤]進行其他信號通路相關指標檢測及滑膜細胞培養實驗，進一步確定痹證寧對RA的治療及多靶點作用機制。

參考文獻

[1] ANGELOTTI F，PARMA A，CAFARO G，et al.One year in review 2017：pathogenesis of rheumatoid arthritis[J].Clin Exp Rheumatol，2017，35（3）：368.

[2] 杜君宏，董秉丹.甲氨蝶呤單用及與白芍總甙聯用治療類風濕關節炎的臨床療效比較[J].中國中西醫結合雜志，2005，25（6）：540-542.

[3] VAN VOLLENHOVEN RF，EMERY P，BINGHAM CO，et al.Long-term safety of rituximab in rheumatoid arthritis：9.5-year follow-up of the global clinical trial programme with a focus on adverse events of interest in RA patients[J].Ann Rheum Dis，2013，72（9）：1496-1502.

[4] KOIKE T，HARIGAI M，INOKUMA S，et al.Effectiveness and safety of tocilizumab：postmarketing surveillance of 7901 patients with rheumatoid arthritis in Japan[J].J Rheumatol，2014，41（1）：15-23.

[5] 何東初，肖靜靜.痹證寧治療類風濕關節炎的臨床療效及安全性觀察[J].現代中西醫結合雜志，2014，23（28）：3090-3092.

[6] 姜輝，劉健，高家榮.五味溫通除痹膠囊對類風濕關節炎風寒濕痹阻證模型大鼠的治療作用[J].風濕病與關節炎，2012，1（6）：23-27.

[7] 劉建磊，李寶麗.制附子對類風濕關節炎抗炎作用的實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（17）：184-187.

[8] 閆福媛，琚堅，高藩，等.威靈仙總皂苷對實驗性NASH大鼠模型血清IL-6、IL-17、TNF-α水平和肝臟病理的影響[J].胃腸病學，2016，21（9）：523-527.

[9] 汪永忠，鄧龍飛，韓燕全，等.威靈仙總皂苷對佐劑性關節炎（AA）大鼠IL-6、IL-10及滑膜中p-JAK2、p-STAT3表達的影響[J].中藥藥理與臨床，2015，31（1）：86-90.

[10] 張夢穎，葛衛紅，姚瑤.青風藤醇提液對關節炎大鼠關節骨破壞的影響[J].醫藥導報，2013，32（5）：565-568.