微刺激方案中成熟卵母細胞紡錘體參數與卵細胞質內單精子注射結局間的關系

黃 亞，吳鋆龍，徐 利，葛鳳菊，陳亞寧，祁秀娟

（上海永遠幸婦科醫院生殖中心，上海 200131）

在人類體外受精-胚胎移植 （in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET）技術中，胚胎質量是影響臨床妊娠結局的重要因素，如何選擇最具發育潛能的胚胎用于移植，既能提高妊娠率，又能減少移植胚胎的數目，一直是生殖醫學領域研究的方向。

成熟卵母細胞紡錘體出現在細胞減數分裂中期（metaphaseⅡ，MⅡ），為中間寬大逐漸向兩邊變窄的紡錘狀細胞結構。MⅡ紡錘體靠近卵母細胞的外圍，一端錨定于卵母細胞皮質區，基本與卵母細胞膜垂直[1]。由大量微管縱向排列而成的紡錘體具有雙折射性，這是一種內部排列高度規律的生物大分子所具有的光學特性，當光進入紡錘體時，會折射成2 束互相垂直、傳播速度不同的2 種偏振光，沿紡錘體短軸行進的偏振光速度較快，而沿長軸行進的速度較慢，從而造成光程差的改變，這種對光的阻滯作用稱為紡錘體的阻滯性[2]。應用偏振光顯微鏡和Oosight Imaging 軟件能夠對紡錘體的阻滯性進行拍攝、測量，并通過特殊的算法對紡錘體照片進行定量分析，計算出光程差的變化量，即阻滯值（單位為nm）。已有研究表明，卵母細胞紡錘體的存在及阻滯值與卵細胞質內單精子注射 （intra cytoplasmic sperm injection，ICSI）的結局有關[3]，阻滯值越大，提示紡錘體中的微管排列越有序，胚胎具有更好的發育潛能[4]。但以往各研究中促排卵方案不盡相同，卵子成熟度也不甚同步，造成數據與結論不一致[5-6]。本文回顧性分析在本院生殖中心采用克羅米芬加人絕經期促性腺激素（human menopausal gonadotropin,hMG）微刺激方案促排卵（該方案為我院的主流特色方案，其他中心只用于少數患者），并應用紡錘體觀察儀觀察行ICSI 助孕患者卵母細胞的紡錘體，探討紡錘體是否可見以及阻滯值等參數與ICSI 結局間的關系，以期為臨床預測優質胚胎、囊胚形成的概率及挑選胚胎移植提供參考依據。

資料與方法

一、資料

2017 年12 月至2019 年6 月間，收集在上海永遠幸婦科醫院生殖中心應用紡錘體觀察儀觀察卵母細胞紡錘體后而行ICSI 患者的臨床資料。本研究獲得上海永遠幸婦科醫院倫理委員會的批準。

二、方法

1.患者的納入及分組： 根據ICSI 前能否觀察到紡錘體分為可見紡錘體組（SP+）和未見紡錘體組（SP-）；再根據患者年齡分為＜35歲組、35～40歲組、≥40歲組3個亞組。排除輸卵管積水、子宮內膜異位癥、卵巢囊腫等可能影響卵子質量和受精結局的患者；排除經皮睪丸附睪穿刺取精行ICSI 的患者等；排除采用卵子激活后行ICSI 的患者以及取卵日確認為未成熟卵母細胞而進行體外培養成熟后行ICSI 的患者。

2.促排卵方案:采用克羅米芬加hMG 微刺激方案促排卵?；颊哂谠陆浿芷诘? 日開始口服枸櫞酸氯米酚 （高特制藥有限公司）50 mg/d 至扳機前1 d；在月經周期第8 日開始給予肌肉注射尿促性素（hMG，麗珠醫藥集團股份有限公司）150 IU，隔天1 次。當主導卵泡直徑≥18 mm 且每個卵泡平均血雌二醇水平≥200 pg/mL 時扳機，予皮下注射醋酸曲普瑞林（達必佳，輝凌制藥公司）0.1 mg，扳機35 h 后取卵。

3.卵子和精子準備:經陰道B 超引導下取卵，對獲取的成熟卵母細胞（MⅡ卵）培養2～3 h 后用透明質酸酶消化去除卵母細胞周圍的顆粒細胞，待觀察紡錘體和行ICSI。精液采用Pureception（SAGE，美國）密度梯度離心法處理，處理后置于室溫，待行ICSI。

4.紡錘體的觀察與ICSI 操作： 使用由特殊材料制成的ICSI 操作皿（NIPRO，日本）進行紡錘體觀察。每個操作皿用預先平衡好的含50%血清替代品（serum protein substitute,SPS） hepes 緩沖的人輸卵管液做3～5個小滴，將卵母細胞和精子加入不同的微滴中。使用Oosight 紡錘體成像系統（HAMILTON THORNE，美國）進行觀察，首先在Live Video模式下選擇液滴的空白區域扣除背景，然后在Live Oosight 模式下拍攝有紡錘體的卵母細胞圖像，利用Oosight Meta 軟件測量紡錘體長度、寬度及阻滯值、紡錘體與第一極體的角度。拍攝完成后，把紡錘體置于6 點鐘或12 點鐘位置進行常規ICSI 操作，操作后的卵子按順序轉入20 μL 卵裂液（SAGE，美國）微滴中，每滴一個卵子，即放置入37 ℃下5%CO2、5%O2、90%N2的三氣培養箱 （KITAZATO，日本）中進行單胚胎培養。

5.評價指標

（1）受精判定：行ICSI 后16～20 h 觀察受精情況，見雙原核（2PN）為正常受精，單原核（1PN）或多原核（≥3PN）為異常受精。正常受精率=正常受精卵母細胞數/MⅡ卵數×100%；異常受精率=異常受精卵母細胞數/MⅡ卵數×100%。

（2）卵裂期胚胎評價：本中心結合2018 年《人類輔助生殖技術胚胎實驗室數據質控專家共識》與本中心情況，將卵裂期胚胎質量分為5 級，見表1。本研究的優質胚胎（優胚）是指受精第2 天細胞數為3～5個或者第3 天細胞數為6～10個，并且胚胎級別為Ⅰ～Ⅱ級的胚胎，優先冷凍Ⅰ～Ⅱ級優胚，Ⅲ～Ⅳ級胚胎全部行囊胚培養，形成囊胚再冷凍，Ⅴ級胚胎直接廢棄。卵裂率=卵裂胚胎數/正常受精卵母細胞數×100%；優胚率=優胚數/正常受精卵裂胚胎數×100%；囊胚形成率=囊胚形成數/囊胚培養數×100%。

6.凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer,FET）：全部采用激素替代周期準備內膜，從月經開始第10 天起采用B 超觀察子宮內膜厚度及形態，當內膜厚度≥8 mm 時，解凍胚胎行單胚胎移植。移植后常規采用黃體支持。移植后第14 天檢測血清β 人絨毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotropin β，β-HCG） 水平，β-HCG 陽性者判定為生化妊娠，2 周后行B 超檢查，宮腔內見到孕囊或原始心管搏動者判定為臨床妊娠。

7.統計學處理：應用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析，呈正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較用t 檢驗；計數資料采用頻數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。不同年齡亞組間的比較采用one-way ANOVA 分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

一、患者及獲卵情況

本組共納入354例患者，平均年齡為 （37.4±5.3）歲，共獲卵1 542 枚，其中MⅡ卵1 095 枚，可見紡錘體組（SP+）915 枚（83.56%），未見紡錘體組（SP-）180 枚（16.44%）。各年齡亞組患者的卵泡刺激素 （follicle-stimulating hormone，FSH） 水平差異顯著，其中≥40歲組[（14.99±12.21） U/L]顯著高于＜35歲組[（12.28±8.35） U/L]以及35～40歲組[（12.22±1.66）U/L]（P 分別為0.032、0.019）。3個年齡亞組間的抗米勒激素（anti-Müllerian hormone，AMH）差異顯著，隨著年齡的增高而下降[（2.09±2.02） U/L 比（1.34±1.66） U/L 比（0.78±0.87） U/L]（P 均＜0.001）。隨年齡增高，各年齡組的人均獲MⅡ卵數有逐漸降低的趨勢，但差異尚無統計學意義（P=0.189），而人均獲SP+卵數顯著降低，隨年齡組由小到大依次為（3.30±2.22）個、（2.91±2.10）個和（2.46±1.99）個（P=0.025）?；颊咂渌话闱闆r及激素水平見表2。

二、有無可見紡錘體與ICSI 結局間的關系（見表3）

SP+組的正常受精率、卵裂率、優胚率、囊胚形成率及臨床妊娠率均顯著高于SP-組，差異均有統計學意義 （P＜0.05），SP+組異常受精率則低于SP-組（P＜0.000 1）（見表3）。

三、紡錘體的阻滯值等參數與ICSI 結局間的關系

在SP+組中，根據紡錘體阻滯值、體積、面積以及紡錘體與第一極體的角度共4個參數進行比較，只有紡錘體阻滯值在正常受精組與異常受精組、卵裂組與未卵裂組、優胚組與非優胚組、囊胚形成組與囊胚未形成組、臨床妊娠組與臨床未妊娠組之間的差異均有統計學意義，其他幾個參數在上述4 組中差異均沒有統計學意義（見表4）。

表1 卵裂期胚胎質量評價體系

表2 各年齡亞組患者激素水平與獲卵情況

表3 有無可見紡錘體的ICSI 結局比較（%）

表4 紡錘體阻滯值等參數與胚胎發育結局間的關系

四、患者年齡與紡錘體阻滯值的關系

統計不同年齡組紡錘體阻滯值可以看出，隨著年齡的增長，3 組的紡錘體阻滯值逐漸降低[分別為（2.1±0.6） nm、（2.0±0.6） nm 和（1.9±0.5） nm]，＜35歲組的紡錘體阻滯值顯著高于其他2 組，差異有統計學意義（P=0.02 和P＜0.001），35～40歲組與≥40歲組間差異沒有統計學意義（P=0.098）（見表5）。

表5 不同年齡組紡錘體的阻滯值

討論

一、影響紡錘體可見的因素

人卵母細胞的紡錘體是桶狀或紡錘狀的細胞結構，分別出現于卵母細胞第一次減數分裂中期（MⅠ）和第二期減數分裂中期（MⅡ）。紡錘體通過微絲與染色體相互作用，在不同時期引導染色體的排列、運動和分離。以往研究提示可觀察到紡錘體的百分比差異較大，Wang 等[7]在研究中觀察到紡錘體的卵母細胞百分比為61.4%，而在García-Oro等[2]的研究中這一百分比為80.5%，造成這種差異的原因除了患者群體和促排卵方案的不同之外，還可能是由于人卵母細胞的紡錘體比較脆弱，容易受到外界環境的影響（如溫度和pH 的波動），造成了微管的解聚[7]。Madaschi 等[8]僅在65.9%的卵母細胞中觀察到了紡錘體，也可能是由于觀察儀器的不同或者觀察時間點不同。本研究由于觀察的都是成熟卵母細胞，因此有83.56%的卵母細胞都觀察到了紡錘體。隨著年齡增長，卵巢功能逐漸衰退，本研究中3個年齡亞組的人均獲卵數以及人均可見紡錘體MⅡ卵數也隨之降低。

二、紡錘體可見與否及阻滯值等參數與胚胎發育、妊娠結局間的關系

在第二次減數分裂過程中，紡錘體通過微管與染色體結合，引導姐妹染色單體發生有序分離。紡錘體異常往往導致受精失敗或異常、胚胎染色體異常、胚胎死亡、自然流產和遺傳性疾病的發生[7]。本研究中未見紡錘體的MⅡ卵異常受精率顯著高于可見紡錘體的MⅡ卵，說明紡錘體的缺失可能會造成染色體的分離失敗，從而導致原核形成異常。朱亮等[9]的研究也證實了紡錘體對于胚胎早期卵裂（ICSI 后25～27 h）的發生起到顯著的作用。有文獻報道，可見紡錘體的MⅡ卵與未見紡錘體的MⅡ卵在幾個重要的實驗室質控數據（受精率、正常受精率、異常受精率、卵裂率等）上都有明顯的差異[2,8,10]。本研究得出相同結論，而且本研究發現有紡錘體的MⅡ卵行ICSI 受精后囊胚形成率及臨床妊娠率更高，即有更好的臨床結局。

紡錘體的結構異常會導致非整倍體卵子和胚胎，對ICSI 后胚胎發育的妊娠結局有不利影響[1]。已有研究對阻滯值與原核評分[11]、胚胎評級[12]和囊胚形成[13]之間進行分析，結果表明較高的阻滯值提示組成紡錘體的微管具有更高的密度和更有序的排列，預示胚胎可能有更好的發育潛能，其結局會更好。在García-Oro 等[6]最近的薈萃分析中表明阻滯值可作為評判紡錘體結構的標準，其大小與妊娠率和活產率的高低都存在的顯著的關系。Tomari等[14]的研究指出，卵母細胞紡錘體阻滯值高者較該值低者有更好的正常受精率、優胚率、囊胚形成率以及后續的臨床妊娠率，但卵裂率無差異。本研究中正常受精組、卵裂組、優胚組、囊胚形成組以及臨床妊娠組的阻滯值均顯著高于異常受精組、未卵裂組、非優胚組、囊胚未形成組及臨床未妊娠組，與前人的研究結論基本一致。同時,本研究測量了紡錘體的長和寬，計算紡錘體的體積、面積，但沒有發現這2個指標在各組間存在差異。另一方面，2013 年Korkmaz 等[5]發表的研究中對于紡錘體預測著床率有不確定的看法，這可能是由于各生殖中心胚胎評級標準不盡相同，而且影響著床率的因素有多個，因此該結果仍需更大的樣本量加以分析，可進一步結合囊胚培養及移植后的臨床結果，從而得出更為準確的判定。

近年來，隨著社會的發展和醫療水平的提高，女性的生育觀念發生變化，生育年齡也在不斷提高,同時“全面二胎”政策的開放，高齡婦女的再生育問題也給輔助生殖技術提出了更大的挑戰。高齡是導致人工助孕失敗的重要因素之一，關于紡錘體阻滯值研究的2 篇文獻都指出[11-12]，隨著年齡的增長，紡錘體阻滯值出現下降的趨勢。本研究也有相同的結果，尤其是40歲以上婦女卵母細胞的紡錘體阻滯值與35歲以下者相比，有顯著下降。因此，評估紡錘體阻滯值，選擇紡錘體可見而且阻滯值高的胚胎或者囊胚進行移植，胚胎發育潛能更好，而患者越年輕對提高成功率越有幫助。

綜上所述，紡錘體的缺失常常會意味著受精異常的風險,隨著年齡的增高，紡錘體的阻滯值逐漸降低。在行ICSI 前，胚胎學家應觀測紡錘體是否存在，把紡錘體放在6 點或12 點的位置行ICSI 而不是傳統的以第一極體為基準，從而可提高正常受精率和卵裂率，盡量降低異常受精的概率，增加有效胚胎的數量，優選阻滯值高的卵子發育成的優胚進行移植，以提高臨床妊娠率。但本研究中樣本量不是足夠大，尤其是陰性結果的樣本偏少，還應納入更多的樣本，隨訪更多樣本的移植結局（著床率和活產率）綜合分析，從而更準確地評估阻滯值對優胚和囊胚形成以及對移植結局的預測價值。