日本結縷草修剪后防御響應的分子機制

何旭升， 徐志高， 劉敏杰

(國家林業和草原局中南調查規劃設計院，長沙 410014)

機械損傷脅迫諸如修剪、踐踏等在自然界中普遍存在，也是植物在其生命周期中不可避免的一種非生物脅迫。為了應對這樣的脅迫環境，植物已經進化出了一套完整的應激響應機制，來抵御受創傷后的一系列不利因素。目前植物應對機械損傷脅迫防御響應機制的研究主要在擬南芥(Arabidopsisthaliala(L.) Heynh)等模式植物中進行[1]。研究發現，植物創傷傷口的周圍會產生大量的活性氧(Reactive Oxygen，ROS)類物質[2]，這些ROS類物質能夠與植物激素相互作用，從而影響下游的防御信號因子來調控相應的防御響應[3]?，F有研究表明，ROS能夠通過促進重要的防御類植物激素脫落酸(ABA)的生物合成，以及抑制ABA的降解，使得植物內源ABA水平升高。而ABA又能促進植物保衛細胞產生ROS類物質，因此植物在受到機械損傷脅迫后會產生ROS類物質和植物激素ABA之間的正反饋調節，從而介導植物氣孔的關閉，增強植物的防御[4-5]。此外，研究人員還發現ABA能夠通過促進另一種重要防御類植物激素茉莉酸(JA)的生物合成來激活植物防御響應[6]。

植物激素JA是公認的植物應對機械損傷脅迫重要的信號物質， 植物創傷會導致植物內源JA水平的升高，從而促進防御反應的信號轉導過程，以此激活植物的防御響應[7]。研究發現，當番茄葉片受到機械損傷時，其內源JA水平升高，同時JA介導的信號轉導基因和下游的防御基因也在數小時內被激活[8-9]。另外，JA以及其信號轉導途徑也是植物抵御昆蟲或食草類動物所必須的，而具有JA合成缺陷或對JA信號有感知缺陷的擬南芥突變體，更易遭受昆蟲的襲擊[10-11]。最新的研究表明，JA還可以抑制植物生長相關基因的表達，從而抑制參與植物生長和代謝(光合作用)相關酶的合成，使植物可以將更多的資源用于防御響應[12]。因此，植物激素ABA和JA在植物應對機械損傷脅迫的過程中發揮著重要的作用。

日本結縷草(Zoysiajaponica)是禾本科多年生暖季型草坪草，因具有優良的耐修剪和踐踏的特性，廣泛應用于運動場草坪和園林綠化。日本結縷草這個特性也使它成為研究禾本科草地植物修剪后防御響應機制的理想材料，但是目前對其這一方向的研究還很少。為了探究日本結縷草修剪后防御響應的分子機制，本研究對日本結縷草品種“Zenith”在修剪后0，2，6 h和24 h四個時間點，創傷葉片的過氧化氫(H2O2)含量及細胞膜透性進行檢測，以探究其葉片創傷程度隨時間的變化。同時通過對內源JA和ABA水平的檢測，以及這兩種植物激素信號轉導途徑四個關鍵基因相對表達量的檢測，來探究JA和ABA對修剪后日本結縷草防御響應的影響。為提高禾本科草地植物的耐修剪和抗踐踏性能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1)植物材料。日本結縷草(Zoysia japonica)品種“Zenith”，由美國Hancock種子公司(Hancock Seed Inc)提供。盆栽種植于室內，所用基質為泥炭∶蛭石∶砂=2∶2∶1，溫度25 ℃，相對濕度50%～70%。將生長至兩個月的未分蘗植株用剪刀修剪至4 cm高，分別在修剪后的0，2，6 h和24 h四個時間點進行取樣(0為剛修剪完取樣，作為對照)。每個時間點三次重復，取樣部位為葉片部分，所取樣品立即用液氮速凍處理后放-80 ℃保存。

2)試劑。Eastep Super總RNA提取試劑盒(Invitrogen，China)，M-MLV反轉錄酶(Promega， USA)，熒光定量試劑購自北京全式金公司的TranScriptⅡ Green one-Step qRT-PCR SuperMix、Tip Green Qpcr SuperMix。

3)儀器 。NanoDrop2000超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific，USA)，PCR儀(Biometra，German)，ABI stepone實時熒光定量PCR儀(ABI，USA)。

1.2 方法

1.2.1 過氧化氫水平和細胞膜通透性的測定

利用3，3'-二氨基聯苯胺染色法(DAB染色法)測定葉片傷口處的過氧化氫含量，每個圖片代表了超過10個樣品在每一個時間點(修剪后0， 2， 6h和24 h)的三個獨立實驗中的染色情況。

參考王學奎的方法對葉片進行相對電導率的測定[13]，以此來檢測受傷葉片的細胞膜透性。每個時間點3次重復。

1.2.2 植物激素水平測定

采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)分別測定修剪后日本結縷草葉片內源ABA和JA的含量。具體操作步驟參考ELISA試劑盒說明書，根據說明書的計算公式以及稀釋倍數可計算出植物激素水平。

1.2.3 RNA提取及反轉錄

取50～100 mg冷凍樣品用液氮研磨，隨后依照Eastep Super總RNA提取試劑盒說明書的方法進行RNA的提取。得到的樣品RNA經由經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用NanoDrop2000 超微量分光光度計測其濃度及OD260/OD280。最后采用M-MLV反轉錄酶對RNA進行反轉錄，反轉錄方法參照試劑盒操作方法，得到的反轉錄產物經Actin[14]檢測后稀釋至200 ng/μL[15]。

1.2.4 引物設計

從已發表的日本結縷草基因組數據庫[16]中獲得ZjCOI1、ZjMYC2、ZjPP2C和ZjSNRK2四個基因的保守序列，然后用primer 5.0軟件進行引物設計。

ZjCOI1基因引物序列為：上游引物5' ATCTTACTCCTGCCCTTTGGAAACA 3'，下游引物5' GCTGTAGCGGAGGTGTAGTGAAATA 3'；

ZjMYC2基因引物序列為：上游引物5' ATGCAATGCGTGCTTAATCATACT 3'，下游引物5' CGATACCGTTACTCTTACCCACCT 3'；

ZjPP2C基因引物序列為：上游引物5' TTGTCACTGGCTGTTCACCAAACC 3'，下游引物5' TGTGATGTAGCACGCAAACGGATA 3'；

ZjSNRK2基因引物序列為：上游引物5' CGTATCTTTGTTGCCAATCCTGC 3'，下游引物5' TTATCGTATTCACCTTCCTCGTT 3'。

1.2.5 普通PCR

利用引物設計軟件設計的引物進行普通PCR擴增，反應體系50 μL，一次加入Tag酶Mix 5 μL，上下游引物各1 μL，樣品RNA 1 μL，去離子水2 μL。反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35次循環；最后72℃延伸5 min，12 ℃保溫。

1.2.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

采用ABI stepone 熒光定量PCR儀進行進行基因的相對表達量檢測，參照北京全式金公司的試劑盒TranScriptⅡ Green one-Step qRT-PCR SuperMix的操作步驟進行上機反應。每個樣品4個重復，結果采用2-△△CT算法進行基因相對表達量的量化分析[17]。

1.2.7 數據分析

所有數據均采用Microsoft Office Excel 2003與SPSS V19.0軟件進行數據整理及差異性分析。

2 結果

2.1 創傷葉片過氧化氫含量和細胞膜透性

機械損傷會破壞植物細胞膜的結構，同時會導致活性氧類物質過氧化氫(H2O2)在傷口處聚集[18]。通過對修剪后的日本結縷草葉片進行DAB染色和相對電導率(EL)的檢測，來判定傷口處的H2O2含量和細胞膜結構完整性。

試驗結果顯示，H2O2在創傷部位迅速的積累(圖1)。修剪后的0， 2， 6 h和24 h的創傷葉片中，0時點(圖1A)的染色程度最高，在2 h(圖1B)下降，在6 h和24 h(圖1C和1D)的H2O2染色水平最低，表明創傷葉片的H2O2水平在修剪后爆發然后逐漸下降。細胞膜透性的試驗結果顯示，0時點創傷葉片的細胞膜透性顯著高于其它三個時間點(P<0.05，圖2)，這表明細胞在修剪后的0時點損傷最嚴重；在2 h時，EL明顯下降，但仍高于6 h和24 h的水平(P>0.05)；而6 h和24 h兩個時間點的EL水平無顯著差異(P>0.05)。細胞膜透性的結果與DAB染色結果一致，呈先爆發后下降至平穩的趨勢。上述試驗結果表明，修剪后的創傷葉片細胞在0時點受傷最為嚴重，在修剪后的6 h內逐漸恢復，24 h無明顯變化。

圖1 創傷葉片的DAB染色

圖2 創傷葉片的相對電導率(EL)注：***指 P<0.001

2.2 創傷葉片內源JA和ABA水平

植物應對機械損傷脅迫的防御響應受到多種因素的影響，植物激素在這一過程中發揮著重要作用，機械損傷會導致植物的JA和ABA水平顯著的變化[19-20]。

因此，本研究對修剪后日本結縷草葉片中的JA和ABA含量進行了檢測，試驗結果如圖3。修剪后葉片的JA含量沒有顯著變化(P>0.05)(圖3A)。但是ABA的水平隨著時間的推移發生了顯著的變化，在修剪后2 h和24 h 的ABA水平要顯著高于修剪后6 h的ABA水平(P<0.05)(圖3B)，0時點和其他時間點的ABA水平沒有顯著差異(P>0.05)。表明，兩種植物激素在修剪后日本結縷草葉片中表現出不同的變化趨勢，JA變化相對平穩，而ABA水平在0～24h內呈動態變化。

圖3 修剪后日本結縷草葉片的JA和ABA水平注：*指P<0.05， **指P<0.01。

2.3 創傷葉片JA和ABA信號轉導基因相對表達量情況

為了進一步探究植物激素JA和ABA在修剪后日本結縷草防御響應中的作用，本研究利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分別測量了修剪后0， 2， 6 h和24 h的JA和ABA信號轉導途徑中關鍵基因的相對表達量，結果如圖4。

圖4 損傷過程中激素信號轉導相關基因的表達注：*指P<0.05， **指P<0.01， ***指P<0.001。

COI1(Coronatine-insensitiveprotein1)是JA信號轉導途徑的關鍵基因，COI1能促進信號因子MYC2的釋放，以此來激活JA信號轉導途徑，被釋放的轉錄因子MYC2進而能夠調控下游防御基因的表達，使植物產生防御應答[21-22]。在修剪后的日本結縷草葉片中，ZjCOI1基因和ZjMYC2基因在2， 6 h和24 h三個時間點的表達量都顯著上調(P<0.05)(圖4A)。

PP2C和ZjSNRK2是ABA信號轉導途徑中兩個關鍵基因，PP2C能夠通過去磷酸化作用來抑制ZjSNRK2，從而抑制ABA信號通路[23]。當日本結縷草被修剪后，ZjPP2C在三個時間點顯著下調(P<0.05)，而ZjSNRK2在2 h和6 h時顯著上調(P<0.05)，但在24 h的表達水平與0時點無顯著區別(P>0.05)(圖4B)。表明，兩種與植物防御相關的植物激素JA和ABA的信號大多在2， 6 h和24 h激活。

3 討論

機械損傷脅迫會誘導植物產生多種防御響應，其中ROS的爆發是最廣為人知的。ROS是植物在遭受脅迫后產生的一種特殊的物質，能夠作為一種信號因子，傳遞脅迫信號從而引起系統的防御應答[24]。本研究試驗結果顯示，受傷的葉片在0時點的染色程度最高，在2 h時開始下降，6 h和24 h時的染色水平達到最低，這樣的結果表明在修剪后的日本結縷草葉片中出現了ROS的爆發，隨后細胞又產生了ROS的消除反應。

研究表明，ROS能夠促進ABA的生物合成或抑制ABA降解，導致細胞內游離ABA水平升高[5，25]。ABA是植物應對外界脅迫的重要植物激素，主要參與植物的滲透調節、病害預防等[26]。還有一些研究表明，ABA介導的MAPK信號通路能夠誘導CAT1(Catalase)基因的表達，從而抑制H2O2的水平[27]。從本研究ABA水平的變化中可以看出，日本結縷草創傷葉片的ABA水平在6 h時出現下降趨勢，但并沒有與創傷葉片的H2O2一樣呈現持續的下降，而是在24 h時又出現上升。據此推測在日本結縷草中也存在ROS爆發所誘導的ABA的生物合成過程以及ABA介導的H2O2抑制過程。同時，應該還存在另外的機制來誘導葉片中已經下降的ABA水平在24 h又重新上升。植物激素ABA的信號轉導途徑在受傷的日本結縷草中也起著重要的作用。qRT-PCR結果表明，ABA信號在6 h時更加活躍。研究表明，ABA可以通過胼胝質的合成來提高植物防御[28]。結合本研究之前創傷葉片H2O2和細胞膜透性的結果，可知在修剪后的日本結縷草中也存在該防御過程。

植物激素JA在植物應對機械損傷脅迫的過程中發揮著至關重要的作用，JA信號轉導途徑和防御基因會在受到創傷后的幾小時內被系統性的激活[8-9]。另外，JA以及其信號轉導途徑也是植物抵御昆蟲或食草類動物所必須的[10-11]。本研究的試驗結果表明，創傷葉片的內源JA水平在6 h都保持較高水平；JA信號轉導途徑在6 h時更加活躍。這些結果與前人的研究結果一致，因此可知在修剪后的日本結縷草中也存在JA信號轉導途徑參與的抵御外界昆蟲啃食的防御響應。

綜上所述，JA和ABA通過其信號轉導途徑參與了日本結縷草修剪后的防御響應，可能通過消除創傷葉片處的H2O2、修復創傷葉片傷口以及抵御食草昆蟲侵襲等途徑來激活和增強植物的防御響應。本文初步探究了日本結縷草修剪后防御響應的分子機制，證明了植物激素JA和ABA在日本結縷草應對機械損傷脅迫的防御響應中發揮了重要作用，為提高禾本科草地植物耐修剪和抗踐踏性能提供了理論基礎。