益生菌和不同水平殼聚糖對黃金鯽非特異性免疫力及抗病力的影響

于景艷，王 洋#，曾祥茜，吳 旋，楊 廣，朱國霞，白東清

（1.天津農學院水產學院 天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津西青 300384；2.天津市水產研究所 天津市海洋牧場技術工程中心，天津濱海 300457；3.天津市靜海區畜牧水產業發展服務中心，天津靜海 301600）

黃金鯽是2008 年審定通過的淡水魚類新品種，該魚是以散鱗鏡鯉做母本，以紅鯽魚作為父本進行雜交獲得的三倍體品種。體型似鯽魚，體色金黃，有一對觸須。生長快、抗應激能力強、推廣面積廣、適合多種養殖模式。研究發現適宜的益生菌可以有效提高彭澤鯽 （齊欣等，2007；尹軍霞等，2007）、重口裂腹魚（何敏等，2008）、西伯利亞鱘（高欣等，2009）、凡納濱對蝦（胡毅等，2008）等水產動物的生長、存活、消化和腸道健康。殼聚糖作為唯一天然的堿性多糖，其分布廣，無毒害，能降低大鼠和小鼠的血糖和血脂（魏濤等，2000），吸附Cd2+和 Pb2+（程珊珊等，2011），有效抑制金黃色葡萄球菌（葉磊等，2004），提高暗紋東方鲀和異育銀鯽的免疫能力及生長性能（陳勇，2010；華雪銘等，2007、2006）。鑒于此，本文以淡水經濟魚類黃金鯽為研究對象，在基礎日糧中添加等量枯草芽孢桿菌和不同水平殼聚糖，探究益生菌和殼聚糖對黃金鯽生長性能、消化酶活性、部分生化指標及抗病力等方面的綜合影響，并選出殼聚糖的適宜添加量，為開發黃金鯽免疫增強劑提供數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗魚及養殖管理 試驗所需的黃金鯽魚種采購自天津漢沽高莊漁場，初始體重 （58.94±4.29）g，初始體長（14±0.10）cm，健康無病無傷，隨機分為6 個組，每組4 個重復，每個重復20 尾魚，養殖容器為（80 cm×60 cm×65 cm） 的 PVC 白色周轉箱，飼養于實驗室水族缸中。放養前先用10 mg/L的戊二醛溶液對24 個水族缸浸泡消毒30 min，后用清水涮洗水族缸2 次。先用基礎飼料養殖7 d，待魚攝食正常后正式開始試驗。每天定時投喂3次 （7：30、13：30、19：30），投餌率為 3%（根據水質、魚的攝食情況做相應調整，保證魚在30 min內吃完為宜，若30 min 沒有吃完，下頓要減少投喂量）。養殖期間保證24 h 不間斷充氧，控制水溫在25～28 ℃，每天早上吸污一次，同時換水1/2，換入曝氣2 d 的水。

1.1.2 養殖飼料 飼喂黃金鯽的基礎飼料購自海大集團成品膨化料，粗蛋白質含量為33%。益生菌購自廣州利洋水產科技股份有限公司，枯草芽孢桿菌≥1.0×109cfu/g，水份≤10%，雜菌數≤1.0×107cfu/g。殼聚糖（純度≥91.3%）外觀顏色為淺黃色粉劑，脫乙酰度95%，水分7%，采購自濟南海德貝海洋生物工程有限公司。將益生菌和殼聚糖事先混合均勻，噴涂在飼料上，在陰涼干燥處晾干備用。本試驗6 個組分別投喂基礎飼料（C1組）、益生菌（C2 組）、益生菌+0.25%殼聚糖（T1組）、益生菌+0.5 殼聚糖 （T2 組）、 益生菌+0.75%殼聚糖（T3 組）和益生菌+1.0%殼聚糖飼料（T4 組）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 養殖30 d 后，禁食24 h 取樣，每組取22 尾，使用麻醉劑MS-222 進行麻醉，測定每組每尾魚體重、體長、體高和體寬，然后擦拭黃金鯽體表后，使用一次性無菌注射器進行尾靜脈取血，4 ℃條件下靜置 1 h，并以 4000 r/min 的轉速離心15 min，制得血清樣品，于-80 ℃超低溫冰箱保存待測。

經尾靜脈取血后的黃金鯽在冰浴條件下進行解剖，分別取頭腎、中腎、肝胰臟、脾臟、腸道、鰓和腦組織。剔除其組織上附著的脂肪、結締組織及器官內容物，置于-80 ℃冰箱內保存。用冷凍離心機在 4 ℃、3500 r/min 離心 10 min，提取上清液，于4 ℃冰箱中冷藏保存。

1.2.2 血液和組織生化指標的測定 生化指標測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，參照說明書進行測定。

1.2.3 抗病力測定 養殖試驗后，用嗜水氣單胞菌進行攻毒，按每尾魚腹腔注射菌液350 μL 計量（總菌數 7×107）。每個平行 5 尾魚，每組 20 尾魚。試驗期為10 d，計算各組魚的累計死亡率和免疫保護率。

1.3 數據統計與分析 采用SPSS 17.0 版軟件進行數據統計和分析，試驗數據用 “平均值±標準差”表示，顯著性水平用P ＜0.05 表示，先對數據作單因子方差分析，如果處理期間有顯著差異，則進行 Duncan’s 多重比較。

2 結果與分析

2.1 飼料中添加益生菌和不同水平殼聚糖對黃金鯽非特異性免疫力的影響

2.1.1 飼料中添加益生菌和不同水平殼聚糖對黃金鯽體內SOD 活性的影響 養殖30 d 后，各組黃金鯽體內不同組織中SOD 活性大小順序為：肝胰臟＞血清＞脾臟＞腦＞頭腎＞中腎＞鰓（表1）。從表1 中看出，與C1組相比，單獨添加益生菌對黃金鯽體內SOD 活性影響很小，C2 組血清、 肝胰臟、脾臟、頭腎、中腎、腦和鰓中SOD 酶活性僅比C1組提高 0.56%、0.66%、1.19%、14.76%、4.60%、1.28%和 1.01%（P＞0.05）。隨著殼聚糖添加水平的增加，體內SOD 活性均呈先上升后下降的趨勢。T1～T3 組血清中SOD 活性分別提高2.92%～3.50%、6.58%～7.17%和 7.07%～7.66%，顯著高于 C1 和 C2 組（P ＜ 0.05），最高值出現在 T3 組，且與T2 組之間差別不大。T2 組肝胰臟酶活性最高，除與T3 組差別不大外，顯著高于其余各組（P＜ 0.05）；與 C1、C2、T1 和 T4 相比，T2 組酶活性分別提高7.07%、6.37%、5.80%和 6.24%。T3 組脾臟酶活性最高，顯著高于 C1、C2 和 T1組，SOD 活性分別提高 25.52%、24.04%和 19.51%（P ＜ 0.05）。頭腎中酶活性最高值出現在T3 組，顯著高于C1和C2 組，SOD 活性分別提高46.05%和 27.27%；T1～T4 組頭腎中 SOD 活性，較 C1組分別提高27.46%、31.95%、46.05%和 28.05%（P ＜ 0.05）。中腎中SOD 活性最高值出現在T3 組，顯著高于其余各組 20.06%～39.48%（P ＜ 0.05）。T2 組腦中SOD 活性顯著高于其余各組30.54%～54.53%（P＜ 0.05）。T2、T3 組鰓中 SOD 活性顯著高于其余各組（P ＜ 0.05），與 C1組相比，T1～T4 組鰓中 SOD活性分別提高7.90%、13.94%、25.00%和6.61%，且其最高值出現在T3 組?？梢婏暳现刑砑?.5%～0.75%殼聚糖可有效提高黃金鯽體內SOD 活性。

表1 不同水平的殼聚糖對黃金鯽體內SOD 活性的影響

2.1.2 飼料中添加益生菌和不同水平殼聚糖對黃金鯽體內CAT 活性的影響 養殖30 d 后，各組體內不同組織中CAT 活性順序為：肝胰臟＞腦＞血清＞脾臟＞頭腎＞鰓＞中腎（表2）。與 C1組相比，C2組對黃金鯽體內CAT 活性影響很小，體內各部位CAT 活性約比 C1組增長 0.54%～12.29%。隨著殼聚糖水平增加，體內CAT 活性均呈現先升高后降低的趨勢。T2～T4 組血清中CAT 活性較C1、C2 和 T1組提高了 23.02%～26.31%、23.74%～28.24%和 9.08%～13.05%，效果顯著（P ＜ 0.05），其中以T3 組酶活性最高，且與T2 組差別不大。T2 組肝胰臟和脾臟中CAT 活性顯著高于其余各組（P ＜ 0.05），肝胰臟內 CAT 酶活性約是其余各組的 1.09～1.15 倍，脾臟中 CAT 酶活性約是其余各組的 1.18～1.43 倍。T3 和 T4 組頭腎中 CAT活性顯著高于其余各組（P ＜ 0.05），T3 組和 T4 組CAT 活性分別提高32.44%～47.96%和27.07%～41.96%，CAT 活性最高值出現在T3 組。中腎中CAT 酶活性高值出現在T3 組，顯著高于 C1 和C2 組（P ＜ 0.05），分別提高 36.67%和 23.62%，而與T2、T4 組差異較小，分別提高4.24%和2.50%。T2 組腦中 CAT 活性最大，是 C1 和 C2 組的 1.27倍和 1.22 倍（P ＜ 0.05），T3 組酶活性也顯著高于C1組（P ＜ 0.05，為 C1組的 1.16 倍）。T2 組鰓組織中CAT 活性最大，約是其余各組的1.15～1.28 倍（P ＜ 0.05）?？梢?，飼料中添加 0.5%～0.75%殼聚糖能夠顯著提高黃金鯽體內的CAT 活性。

2.1.3 飼料中添加益生菌和不同水平殼聚糖對黃金鯽體內GSH 含量的影響 從表3 可以看出，養殖30 d 后，黃金鯽體內不同組織中GSH 含量順序依次為： 肝胰臟＞腦＞血清＞脾臟＞中腎＞頭腎＞鰓。與C1組相比，C2 組除肝胰臟中GSH 含量顯著提高外，其余各組織中GSH 含量變化不大（P＞0.05）。血清中GSH 含量隨著殼聚糖水平逐漸升高，在T4 組達到最大值，較其余各組提高19.84%～43.64%，效果顯著 （P ＜ 0.05）。其余各組織中GSH 含量均隨著殼聚糖添加水平的增加呈現先增加后降低的變化趨勢，其中T2～T4 組肝胰臟中 GSH 含量是 C1組的 1.56 倍、1.46 倍和 1.38 倍（P ＜ 0.05），其中以 T2 組含量最高，較 C1、C2 和T1組分別提高56.19%、18.61%和16.08%，效果顯著（P ＜ 0.05）。脾臟中 GSH 含量最高值出現在 T2組，與 C1、C2、T1、T3 和 T4 組相比，分別提高了52.91% 、49.70% 、45.45% （P ＜ 0.05）、8.46% 和11.92%（P＞0.05）。頭腎、中腎、腦和鰓中 GSH 最大值出現在 T3 組，較 C1、C2 和 T1組分別提高32.02%～49.42% 、59.32%～75.00% 、38.51%～60.47%和 52.96%～60.06%（P ＜ 0.05）。兩個高水平殼聚糖組頭腎中GSH 活性顯著高于其余各組（P ＜ 0.05），T3 組約為低水平和無添加殼聚糖組的1.26～1.49 倍，T4 組約為低水平和無添加殼聚糖組的 1.22～1.45 倍。T2～T4 組中腎中 GSH 含量顯著高于其余各組（P ＜ 0.05）。T2～T4 組腦中GSH 活性顯著高于 C1組（P ＜ 0.05），分別為 C1組的 1.34 倍、1.60 倍和 1.27 倍。T3 組鰓中 GSH活性分別是 C1 和 C2 組的 1.6 倍和 1.59 倍 （P ＜0.05）?？梢?，飼料中添加 0.5%～0.75%殼聚糖能有效提高黃金鯽體內GSH 含量。

表2 不同水平的殼聚糖對黃金鯽體內CAT 活性的影響

2.1.4 飼料中添加益生菌和不同水平殼聚糖對黃金鯽體內GSH-Px 活性的影響 從表4 中可以看出，養殖30 d 后，各組黃金鯽體內的GSH-Px 活性大小順序依次為：肝胰臟＞血清＞脾臟＞頭腎＞中腎＞鰓＞腦。與 C1組相比，C2 組中只有頭腎 GSHPx 活性顯著升高（P ＜ 0.05），其余組織變化不明顯。殼聚糖對黃金鯽體內GSH-Px 活性的影響具有劑量差異性和組織差異性。體內GSH-Px 活性均隨著殼聚糖水平增加呈現先增后降的趨勢。血清中 GSH-Px 活性以 T3 組活性最高，較 C1、C2和 T1組分別提高 8.24%、7.60%和 6.98%（P ＜0.05），T2 組較 C1組提高了 6.47%，效果顯著（P ＜0.05）。殼聚糖添加組肝胰臟中酶活性均顯著高于C1組（P ＜ 0.05），提高 5.09%～12.12%，且 T2～T4 組中酶活性還顯著高于 C2 組（P ＜ 0.05），分別提高 5.70%、8.45%和 6.84%。脾臟中GSH-Px 活性最高值出現在 T2 組，為 88.21，較 C1、C2 和 T1組 分 別 提 高 29.84% 、28.25% 和 25.35% （P ＜0.05）。與C1組相比，頭腎中GSH-Px 酶活性均顯著提高 23.47%～40.12%（P ＜ 0.05）。T2 組和T3組中腎中酶活性顯著高于無添加殼聚糖組 （P ＜0.05），T2 組 較 C1、C2 組 分 別 提 高 26.46% 和19.45%，T3 組較 C1、C2 組分別提高 24.83%和17.91%，其中以T2 組酶活性最高。添加殼聚糖組和 C2 組腦中酶活性均顯著高于 C1組 （P ＜0.05），提高約 2.26%～31.82%，且 T2 組腦中GSH-Px 活性分別是 C1 和 C2 組的 1.32 倍和1.29 倍（P ＜ 0.05）；T3 組鰓中 GSH-Px 活性最高，為 10.49，分別是 C1、C2 和 T1組的 1.50 倍、1.41倍和 1.30 倍，效果顯著 （P ＜ 0.05）。上述可知，0.5%～0.75%殼聚糖能很好的提高黃金鯽體內GSH-Px 的活性。

表3 不同水平的殼聚糖對黃金鯽體內GSH 含量的影響

表4 不同水平的殼聚糖對黃金鯽體內GSH-Px 活性的影響

2.1.5 飼料中添加益生菌和不同水平殼聚糖對黃金鯽體內MDA 含量的影響 從表5 可以看出，養殖30 d 后，與C1組相比，C2 組只有腦中MDA含量顯著降低（P ＜ 0.05），其他組織影響不大（P＞0.05）。黃金鯽體內MDA 含量基本上隨著殼聚糖水平的增加呈現降低的趨勢。T2～T4 組血清中MDA 含量較 C1 和 C2 組降低 16.54%～31.50%和 13.12%～28.69%（P ＜ 0.05），其中以 T4 組最低。T2～T4 組肝胰臟中 MDA 含量較 C1組降低33.68%～53.80%（P ＜ 0.05）。脾臟中 MDA 最小值出現在T4 組，比 C1 和 C2 組降低了 26%和23%（P ＜0.05）。中高水平殼聚糖添加組在頭腎中的MDA 含量顯著低于無添加組和低水平添加組（P ＜0.05），且在 T4 組達到最小值。中腎中 MDA 最小值出現在 T4 組，比 C1 和 C2 組降低了 25%和24%（P ＜ 0.05）。C2 組和添加殼聚糖組腦中 MDA含量均顯著降低，降低幅度為21.13%～58.15%，在 T4 組達到最小值（P ＜ 0.05）。T2～T4 組鰓中MDA 含量顯著低于C1 和C2 組，其中最小組出現在 T3 組 （P ＜ 0.05）。由此可見，飼料中添加0.75%～1.0%殼聚糖對降低黃金鯽體內MDA 含量有顯著效果。

2.1.6 飼料中添加益生菌和不同水平殼聚糖對黃金鯽體內NO 含量的影響 由表6 可知，養殖30 d后，單獨添加益生菌對黃金鯽體內的NO 含量影響很?。≒＞0.05）。血清、肝胰臟、脾臟和腦中 NO含量呈先上升后下降的趨勢，并于T3 組達到最大值，較 C1組分別提高了 72.96%、52.17%、105.26%、163.64%，效果顯著（P ＜ 0.05）；在頭腎、中腎和鰓中呈逐漸上升趨勢，均于T4 組達到最大值（P ＜ 0.05），其中 T4 組在頭腎、中腎和鰓中分別提高20.00%～140.00%、16.67%～133.33%和7.69%～27.27%。由此可見，飼料中添加0.75%～1.0%殼聚糖可有效提高黃金鯽體內NO 含量。

2.1.7 飼料中添加益生菌和不同水平殼聚糖對黃金鯽血清和肝胰臟中GOT 和GPT 活性的影響由表7 可知，養殖30 d 后，隨著殼聚糖水平的增加，黃金鯽血清和肝胰臟中GOT 活性呈現下降趨勢，且在 T4 組達到最小值（P ＜ 0.05）。肝胰臟中GOT 活性下降幅度最大，為88.97%，高于血清（最大下降速度為47.93%）。GOT 活性在血清中的最低值出現在T4 組，較無添加殼聚糖組下降幅度大于 47%（P ＜ 0.05），而肝胰臟中 GOT 活性低值出現在T3 和T4 組，較無添加組分別降低74.12%～76.41%和 87.89%～88.97%（P ＜ 0.05）。

表5 不同水平的殼聚糖對黃金鯽體內MDA 含量的影響

表6 不同水平的殼聚糖對黃金鯽體內NO 含量的影響

表8 顯示，黃金鯽體內GPT 活性的變化規律同GOT。T4 組血清中GPT 活性較其余各組下降幅度均在 30%以上（P ＜ 0.05）；T3、T4 組肝胰臟中GPT 活性低于 C1、C2 和 T1組的 1/2 （P ＜ 0.05），且最小值均出現在T4 組。

表7 不同水平的殼聚糖對黃金鯽血清和肝胰臟中GOT 活性的影響

2.2 飼料中添加益生菌和不同水平殼聚糖對黃金鯽抗病能力的影響 養殖30 d 后用嗜水氣單胞菌進行急性攻毒試驗發現，黃金鯽鰓蓋、鰭、腹部和肛門均出現不同程度的出血癥狀，部分瀕死魚出現腹部嚴重腫脹，肛門發紅、水腫，稍微用力擠壓肛門即有黃色或紅色的腹腔積水流出。解剖發現，病魚鰓充血或出血，腹腔積水嚴重，腸道、肝胰臟發紅充血，脾臟顏色發黑。攻毒5 d 后，只有T2 和T3 組累計死亡率降低，其他各組均為100%（表9）。T2 和 T3 組免疫保護率分別為 40%和60%，因此添加益生菌+0.75%殼聚糖（T3 組）對黃金鯽免疫保護率作用效果最佳。

表8 不同水平的殼聚糖對黃金鯽血清和肝胰臟中GPT 活性的影響

3 討論

表9 不同水平的殼聚糖對黃金鯽抗病力的影響 %

3.1 殼聚糖對黃金鯽非特異性免疫力的影響Siwicki 等（1994）發現，投喂添加0.5%的殼聚糖飼料，虹鱒血清中的總抗體和總蛋白水平分別提高了 36.8%和 14.6%。Esteban 等（2001）在金頭鯛飼料中添加25 g/kg 或50 g/kg 的甲殼素，可以明顯提高補體活性。常青等（2006）研究證明，投喂添加0.5%殼聚糖的飼料，能明顯提高花鱸補體、溶酶菌和吞噬活性。史春路（2008）研究發現，飼料中添加5 g/kg 殼聚糖能顯著提高黃顙魚血液補體C3的含量。王蘭等（2009）研究發現，長江華溪蟹長期浸泡在殼聚糖中，其血清中的AKP 活力顯著提高。童春等（2010）發現，飼料中添加 0.6%～0.8%殼聚糖能增強淡水白鯧免疫能力。曹振杰等（2010）研究表明，投喂不同水平的殼聚糖60 d，試驗組羅非魚生長性能和免疫能力都得到明顯提高，其中0.5%殼聚糖組效果最顯著（P ＜0.05）。張嚴偉等（2014）研究發現，飼料中添加50 mg/kg 的殼聚糖能顯著提高福瑞鯉生長、 非特異性免疫指標和抗氧化能力。肖艷翼等（2017）得出，在飼料中添加2.5 g/kg 殼聚糖，能提高俄羅斯鱘幼魚生長性能，增強其免疫能力。本試驗結果表明，日糧中添加益生菌和不同水平殼聚糖，能顯著提升黃金鯽血清及組織中抗氧化酶 （SOD、CAT、GSH-Px）活性和GSH 含量，降低黃金鯽血液及組織中MDA 含量。且添加0.75%殼聚糖（T3 組）能顯著降低血清中和肝胰臟中GPT 含量，提高體內NO 含量。說明飼料中同時添加益生菌和不同水平殼聚糖能提高黃金鯽體內抗氧化能力和非特異性免疫能力。

3.2 殼聚糖對黃金鯽抗病能力的影響 葉磊等（2004） 發現，50、100、200 kD 分子量的殼聚糖均可以明顯抑制金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌。且分子量越大，抑菌作用減少，相應最小抑菌濃度在 0.5 g/L 以上。閆大偉等 （2007）證實，飼料中添加0.5%～0.75%殼聚糖，可以明顯提高草魚對嗜水氣單胞菌的抗感染能力。庒承紀等（1998）研究表明，在斑節對蝦、羅氏沼蝦苗飼料中加入 25×l0-6～100×l0-6殼聚糖，可抑制氣單胞菌和弧菌繁殖，增強抗病能力，提高蝦苗的成活率。孫琪等（2014）研究表明，使用25 mg/L 的殼聚糖浸泡被水霉感染的草魚發現，殼聚糖具有促進傷口愈合，顯著降低感染草魚死亡率的作用（P ＜0.05）。曹振杰等（2010）得出，在接受過免疫的羅非魚日常飼料中添加0.6%的殼聚糖，能顯著提高其對嗜水氣單胞菌的抵抗力。吳國忠等（2005）通過投喂不同分子量殼聚糖30 d 后，向南美白對蝦體內注射弧菌和白斑病毒發現，低分子量殼聚糖能夠提高南美白對蝦的抗病能力。Cha 等（2008）用殼聚糖包被基礎飼料投喂牙鲆（Paialichthys olivaceus）12 周發現，平均增長率比對照組提高約10%，髓過氧化酶（MPO）、中性粒細胞的呼吸爆發和皮膚黏液溶菌酶等活性均顯著升高（P ＜0.05），累積死亡率為40%，遠低于對照組的70%。在本試驗中，投喂添加益生菌和殼聚糖的飼料30 d后，經腹腔注射嗜水氣單胞菌7 d，0.5%～0.75%殼聚糖組死亡率明顯低于對照組和益生菌組，免疫保護率也明顯低于對照組。表明0.5%～0.75%的殼聚糖能明顯提高黃金鯽的抗病力。至于最高水平和最低水平殼聚糖組死亡率高的原因還有待深入研究。

4 結論

飼料中添加益生菌對黃金鯽非特異性免疫力及抗病力影響不大，而同時添加益生菌和適宜水平殼聚糖可以有效提高黃金鯽體內抗氧化能力，降低肝損傷，有效提高黃金鯽的抗病力。綜上，從免疫角度考慮，黃金鯽飼料中殼聚糖適宜添加水平為0.5%～0.75%。