復合預混合飼料中β-胡蘿卜素測定方法研究

施杏芬，呂偉軍，陳 凱，阮 鑫

（浙江省獸藥飼料監察所，浙江杭州 311199）

β-胡蘿卜素是一種重要的營養性添加劑和天然色素，不僅具有維生素A 的生物活性，而且在增強免疫及抗氧化等方面都有顯著的功效，廣泛應用于食品和動物養殖中。在畜禽養殖中添加β-胡蘿卜素可增強動物的免疫能力，提高成活率，并且可改善動物產品的色澤，從而提高其產品的附加值。農業部2625 號公告《飼料添加劑安全使用規范》中規定β-胡蘿卜素作為維生素類添加劑，可以在養殖動物中添加使用，但其作為著色劑只允許在家禽中按生產需要適量使用?；瘜W合成著色劑毒性 ADI 0～0.03 （FAO／WHO，2001），半致死量 （LD50）＞10 g/kg (小鼠，經口）（顧君華，2007）。目前，還沒有一種飼料中β-胡蘿卜素的測定方法。因此，為從源頭控制畜產品質量安全，監控復合預混合飼料中β-胡蘿卜素的添加水平，建立相應的分析測定方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、 試劑和材料 Aglient 1260 高效液相色譜儀，紫外檢測器；分析天平，梅特勒；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發儀，BUCHI 公司；旋渦儀，TALBYSTM。

全反式β-胡蘿卜素標準品，純度≥95%，北京曼哈格生物科技有限公司；甲醇、色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；異丙醇、色譜純，默克股份有限公司；二氯甲烷、色譜純，天地股份有限公司；石油醚（沸程 30～60 ℃）、無水硫酸鈉、無水乙醇、氫氧化鉀、氯化鈉，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）、L-抗壞血酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；娃哈哈超純水；尼龍針式過濾器 WAT200520（0.45 μm）。

1.2 標準溶液的配制 稱取全反式β-胡蘿卜素標準品50 mg 至100 mL 棕色容量瓶中，加入10 mL二氯甲烷溶解并定容 （GB 5009.83-2016），配成500 μg/mL 的標準儲備液，-20 ℃保存。稀釋配成0.00、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL 系列標準溶液。

1.3 HPLC 分析條件 色譜柱：Aglient SB-C18柱，長 250 mm，內徑 4.6 mm，粒徑 5 μm；流速：1.5 mL/min；檢測波長：450 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流動相：甲醇+異丙醇+二氯甲烷=80+17+3（V/V/V）。

1.4 樣品處理 稱取1 g 復合預混合飼料于已加入1 g EDTA 的三角瓶中，加入50 mL L-抗壞血酸乙醇溶液，加入10 mL 氫氧化鉀溶液，于50 ℃水浴超聲20 min。將該溶液轉移至盛有80 mL 石油醚的分液漏斗中，用水洗三角瓶并入分液漏斗。水相轉移至另一分液漏斗中，用50 mL 石油醚重復提取兩次。用100 mL 飽和氯化鈉溶液洗滌提取液，并用水洗滌提取液至中性，過無水硫酸鈉，轉移至放有幾粒BHT 的棕色容量瓶中，用石油醚定容。分取一定體積于旋轉蒸發器燒瓶，減壓濃縮至近干，用流動相溶解，旋渦混勻。過 0.45 μm 濾膜，供高效液相色譜儀測定。

2 結果與分析

2.1 分析圖譜 β-胡蘿卜素標準溶液色譜圖見圖1，空白復合預混合飼料色譜圖見圖2，添加β-胡蘿卜素的復合預混合飼料色譜圖見圖3。

圖1 標準圖譜

圖2 空白樣品

圖3 加標樣品

2.2 標準曲線 以峰面積為縱坐標，相應標準系列溶液為橫坐標繪制標準曲線，結果顯示β-胡蘿卜素濃度與其對應的峰面積呈良好的線性關系。線性回歸方程、相關系數見表1。

表1 標準曲線的回歸方程與相關系數

2.3 準確度和精密度 在空白的復合預混合飼料中分別添加 β-胡蘿卜素 2、752、1500 mg/kg三個濃度，每個濃度6 個重復，平均回收率為95%～102%，批內 RSD 小于 6%，批間 RSD 小于 4%（表2）。

表2 復合預混合飼料中β-胡蘿卜素的回收率測定結果

2.4 檢測限和定量限 用本研究方法測定復合預混合飼料中β-胡蘿卜素含量，其檢測限按S/N≥3，為 1 mg/kg；定量限按 S/N≥10，為 2 mg/kg，由表2 可見，添加濃度為2 mg/kg 時，其平均回收率為101.7%，批內RSD 為5.37%，說明該方法檢測性能較好。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 選用不同品牌的C8、C18 色譜柱，按照食品安全國家標準 食品中胡蘿卜素的測定（GB 5009.83-2016）中的色譜條件二測定，大部分色譜峰都有拖尾，只有Aglient ZORBA SB C18 色譜峰對稱較好，幾乎沒有拖尾。因此確定Aglient ZORBA SB-C18 柱作為β-胡蘿卜素的檢測色譜柱。

3.2 流動相的選擇 由于β-胡蘿卜素可溶于丙酮、三氯甲烷、石油醚等，難溶于甲醇和乙醇。通過比較甲醇+乙腈+三氯甲烷=85+12+3(GB 5009.83-2016)、甲醇+乙腈+三氯甲烷=85+12+3（1000 mL中1.0 mL 三氟乙酸）、甲醇+異丙醇=82+18、甲醇+異丙醇=85+15、甲醇+異丙醇+二氯甲烷=80+17+3幾組流動相，只有甲醇+異丙醇+二氯甲烷=80+17+3 的流動相色譜峰比較對稱和尖銳，因此，選擇甲醇+異丙醇+二氯甲烷作為研究的流動相。

3.3 提取試劑的選擇 由于β-胡蘿卜素對光、熱、氧不穩定，不耐酸，弱堿性時較穩定，用堿液皂化后，分別用環己烷、氯仿、石油醚等溶液提取，發現石油醚萃取時回收率比較穩定，故選用石油醚作為萃取液。

3.4 實際樣品檢測 對添加400 mg/kg β-胡蘿卜素的復合預混合飼料進行檢測，測定結果為391 mg/kg。

4 結論

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素的一種，屬于脂溶性化合物，直接提取回收率不高，故本試驗采用堿液皂化，石油醚萃取，建立了復合預混合飼料中β-胡蘿卜素的測定高效液相色譜法，結果表明復合預混合飼料中添加β-胡蘿卜素濃度為2～1500 mg/kg 時，其回收率均在 95%以上，RSD 小于6%。該方法穩定性好，分離度高，具有較好的準確度和精密度，可以滿足日常的檢測需求。