彌漫大B細胞淋巴瘤中CD27的表達及臨床意義

葛曉雯，朱 娜，姚家美，高 峰，曾海英，欒麗娟，紀 元，譚云山，侯英勇

淋巴瘤分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma/Hodgkin’s disease, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)。B細胞型非霍奇金淋巴瘤(B cell non-Hodgkin’s lymphoma, B-NHL)發病率占淋巴瘤的90%以上，其中彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)發病率占B-NHL的30%～60%[1-2]，常見于成人。DLBCL分為生發中心細胞(germinal center B-cell like, GCB)型和非生發中心細胞(non-germinal center B-cell like, non-GCB)型。CD27是腫瘤壞死因子受體超家族的一員，是相對分子質量為5.5×104的Ⅰ型跨膜糖蛋白，與其配體CD70相互作用[3]，參與B細胞成熟過程，表達于記憶B細胞和產免疫球蛋白(Ig)的B細胞等細胞表面[3-4]。文獻報道其在多種B細胞淋巴瘤表面均有不同程度的表達[3]，但其表達的臨床意義仍不明確。本文采用免疫組化EnVision法檢測DLBCL組織中CD27等蛋白的表達，同時采用FISH技術檢測腫瘤組織中MYC、BCL-2、BCL-6基因的重排情況，以進一步明確CD27表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015～2018年復旦大學附屬中山醫院確診且臨床資料完整的143例DLBCL作為研究對象。其中男性77例，女性66例?！?0歲者72例，>60歲者71例，中位年齡60歲。所有DLBCL均依據WHO(2008)診斷標準和2016年修訂標準[5]確診，并應用Hans法則進行分型，其中GCB型68例，non-GCB型75例。Ann Arbor分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期28例，Ⅲ期16例，Ⅳ期83例。國際預后指數(international prognostic index, IPI)評分：0分9例，1分29例，2分31例，3分37例，4分患25例，5分12例。HE、免疫組化均由兩位經驗豐富的病理醫師閱片證實，FISH結果由3名實驗員分別計數，取其平均值。本實驗經復旦大學附屬中山醫院醫學倫理委員會批準(B2018-073R)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 組織芯片經切片后行HE染色及免疫組化EnVision染色。一抗包括CD20、PAX-5、CD10、BCL-6、BCL-2、MUM1、C-MYC、CD3、CD5、Ki-67等，購自北京中杉金橋公司，CD27抗體購自美國Proteintech公司。免疫組化試劑盒購自羅氏診斷產品(上海)有限公司，利用全自動免疫組化染色儀(羅氏公司的BenchMark XT)進行染色。結果判定：CD27陽性定位于細胞膜。>75%的細胞無著色為0分，>75%的細胞淺黃色著色為1分，>75%的細胞黃色著色為2分，>75%的細胞棕黃色著色為3分。0～1分為陰性，2～3分為陽性。

1.2.2FISH檢測 所用探針均購于美國雅培公司(Vysis BCL-2 Break Apart FISH Probe Kit、Vysis BCL-6 Break Apart FISH Probe Kit、Vysis MYC Break Apart FISH Probe Kit)。石蠟切片脫蠟后放入蒸餾水，在82 ℃的蒸餾水中預處理25～30 min，37 ℃胃蛋白酶(Sigma公司)溶液中消化后梯度乙醇脫水、風干，利用Thermo Brite雜交儀(Abbott公司)按探針說明書提供的方法進行操作。在熒光顯微鏡(BX5l，Olympus公司)下觀察。結果判定：正常細胞顯示2個紅色、2個綠色信號。根據本實驗探針屬性，紅、綠信號分離為陽性信號。在CD27免疫組化切片上劃出陽性區域，FISH讀片時依據CD27陽性區域觀察該區域內BCL-2、BCL-6和MYC基因的重排情況，以該區域內腫瘤細胞平均出現15%陽性信號為陽性閾值。每個標本由3名實驗員分別計數，取其平均值。本實驗未將“雙打擊”或“三打擊”高級別B細胞淋巴瘤病例納入研究對象。

1.3 隨訪隨訪以門診或電話方式進行，所有患者隨訪5～57個月，隨訪內容包括患者生活質量、一般情況、近期復查等?？偵嫫?overall survival, OS)指自病理確診至因任何原因死亡的時間。

1.4 統計學分析采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，DLBCL中CD27表達與臨床病理特征的關系行Pearson χ2檢驗，若理論頻數T<5且T≥1，采用χ2檢驗的連續校正公式，若理論頻數T<1，采用χ2檢驗的Fisher精確概率法。生存分析采用Kaplan-Meier分析。以雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DLBCL組織中CD27的表達CD27蛋白的表達定位于細胞膜，代表性FISH陽性結果見圖1。3種FISH探針陽性信號均為紅綠分離。本組實驗中MYC、BCL-2和BCL-6基因易位發生率分別為8.4%、8.4%和25.2%，本實驗未將“雙打擊”或“三打擊”高級別B細胞淋巴瘤病例納入研究對象。143例DLBCL中CD27的0分者27例(18.9%)，1分者70例(49.0%)，2分者32例(22.4%)，3分者14例(9.8%)(圖2)。按本實驗0～1分定義為CD27陰性，2～3分定義為CD27陽性，CD27蛋白陽性者46例，陽性率為32.2%。

圖1 CD27在DLBCL中的表達，EnVision法：A.0分；B.1分；C.2分；D.3分；E.FISH檢測MYC基因重排陽性(箭頭)；F.FISH檢測BCL-2基因重排陽性(箭頭)；G.FISH檢測BCL-6基因重排陽性(箭頭)

圖2 CD27在DLBCL中的表達分布

2.2 DLBCL中CD27表達與臨床病理特征的關系χ2檢驗發現，CD27陽性組中BCL-2基因重排陽性率(17.4%)明顯高于CD27陰性組(4.1%)，差異有統計學意義(P<0.05)。CD27蛋白陰性組及CD27蛋白陽性組的患者年齡、性別、Hans分型、Ann Arbor分期、IPI評分、MYC基因重排及BCL-6基因重排等相比差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 DLBCL中CD27表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

*P<0.05；△連續性校正的χ2檢驗

2.3 DLBCL組織中CD27蛋白表達與預后的關系本組143例DLBCL患者隨訪5～57個月，其中46例CD27陽性患者中14例因疾病死亡，32例至隨訪結束仍生存；97例CD27陰性組患者中15例因疾病死亡，82例患者至隨訪結束仍生存。CD27陽性組患者病死率(30.4%，14/46)明顯高于CD27陰性組(15.5%，15/97)，差異有統計學意義(χ2=4.326，P=0.038)。CD27陽性組OS為(33.8±2.5)個月(95%CI=28.8～38.8個月)。CD27陰性組OS為(49.4±1.8)個月(95%CI=45.8～53.0個月)。Kaplan-Meier生存曲線示，CD27陽性者與陰性者的生存曲線差異有顯著性(χ2=4.485，P=0.034)，陽性組OS較短(圖3)。

圖3 CD27陽性組和CD27陰性組DLBCL患者的生存曲線

3 討論

CD27主要表達于記憶性B細胞、生發中心的B細胞、幼稚T細胞、記憶性T細胞、自然殺傷細胞等細胞表面[3]。正常淋巴組織中CD27表達于濾泡邊緣區和生發中心的B淋巴細胞，不表達于套區。CD27與其配體CD70結合后促進T細胞的活化與增殖，誘導效應T細胞與記憶T細胞的分化與形成[3]。原始B細胞不表達CD27，然而當B細胞受體被激活后，CD27可以長時間表達于B細胞表面，并且在B淋巴細胞的生長、分化等活動中起重要作用。CD27蛋白也可以在B細胞淋巴瘤的細胞表面表達。有研究顯示廣泛的B細胞淋巴瘤表達CD27，如慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、漿細胞瘤/多發性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤和彌漫大B細胞淋巴瘤等[3]，前體B淋巴母細胞淋巴瘤/白血病未見CD27的表達。雖然CD27被認為是幼稚和記憶B細胞的表面標志物[6]，表達于淋巴瘤細胞表面時，不能提示其細胞來源。越來越多的研究證明，CD27表達與淋巴瘤細胞生存、免疫逃逸等密切相關?？扇苄訡D27(sCD27)在Waldenstr?m巨球蛋白血癥腫瘤細胞中表達上調，應用CD27配體CD70的單抗后，腫瘤細胞生長受到抑制[7]。Jak等[8]研究發現慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤組織中通過CD70誘導的調節性T細胞(Tregs)數量增多，且這種Tregs不易凋亡，提示CD27/CD70通路能誘導腫瘤的免疫逃逸。本組143例DLBCL患者中，CD27蛋白陽性者46例，陽性率為32.2%，CD27陽性者與陰性者的Kaplan-Meier生存曲線差異有顯著性(χ2=4.485，P=0.034)，陽性組生存期較短，提示CD27高表達與DLBCL的不良預后有關。

研究發現DLBCL患者中，MYC基因易位發生率約為14%，BCL-2基因易位發生率約為21%，而BCL-6基因易位發生率約為31%[9]。本組中MYC、BCL-2和BCL-6基因易位發生率分別為8.4%、8.4%和25.2%，略低于文獻報道的水平，可能與人群的地區差異及樣本量差異有關。根據WHO(2016)淋巴組織腫瘤分類[5]，將以往的介于Burkitt淋巴瘤與DLBCL形態之間的“灰區”淋巴瘤歸為高級別B細胞淋巴瘤，其中發生MYC、BCL-2和(或)BCL-6基因重排的高級別B細胞淋巴瘤劃分為新的獨立類型，稱為“雙打擊”或“三打擊”高級別B細胞淋巴瘤，其發生率為6%～13%[10]，而未發生者稱為高級別B細胞淋巴瘤，非特指型。目前有研究表明，發生MYC、BCL-2和(或)BCL-6基因重排的“雙打擊”或“三打擊”高級別B細胞淋巴瘤患者預后較差，不管臨床上給予任何治療方案，其中位生存期僅2個月～1.5年[11-13]。為了避免“雙打擊”或“三打擊”對患者預后的影響，本實驗未將“雙打擊”或“三打擊”高級別B細胞淋巴瘤納入分析對象。據統計，約65%的雙打擊淋巴瘤發生的是MYC和BCL-2易位，約14%的雙打擊淋巴瘤發生的是MYC和BCL-6易位[14]。BCL-2是抗凋亡的原癌基因，位于染色體18q21，編碼抗凋亡蛋白，可抑制腫瘤細胞凋亡，發生染色體(14；18)(q32；q21)易位后，會導致BCL-2與IgH基因融合，使BCL-2蛋白異常高表達。已知BCL-2在多種腫瘤中過表達，并且與耐藥相關[15]。BCL-2蛋白表達與DLBCL患者腫瘤的Ann Arbor分期有關[16]。有研究顯示，BCL-2的過表達與DLBCL的不良預后有關[17]。進一步分析發現，單獨的BCL-2重排可以作為DLBCL患者OS較低的預后指標[9,18]。本實驗發現，CD27陽性組BCL-2重排陽性率(17.4%)明顯高于CD27陰性組(4.1%)，差異有統計學意義(P<0.05)，但本組實驗樣本量有限，在大樣本中是否存在這樣的內在聯系及其內在機制有待進一步更深入的探討。

DLBCL患者的預后隨著治療方案的優化已經取得了明顯的改善，但仍有約1/3的患者最終死于耐藥或疾病復發[19]，其耐藥的具體分子機制目前尚不明確。在精準醫學時代，研究影響DLBCL預后的因素有助于對不同患者制定更具有針對性的精準治療方案。本實驗結果提示，CD27高表達與DLBCL的不良預后有關，CD27有望成為評估DLBCL預后的生物學標志物之一。