玉米秸稈生物炭對沉積物中BDE-47生態毒性的影響

向靜，米盈，田斌，龔雙姣，馬陶武

吉首大學生物資源與環境科學學院，吉首 416000

作為水體中各種污染物沉積庫的沉積物是潛在的二次污染源[1]，而受到持久性有機污染物污染的沉積物對水生生物和人類健康具有很大的生態與健康風險。采用低能耗、高效率和對環境干擾小的修復技術對污染沉積物進行原位修復是維持水生態系統健康的重要手段。通常，對污染沉積物修復的主要目標是最大程度地降低污染物的生物有效性和生態毒性。研究證實，黑炭顆?？梢詮娏业匚脚c沉積物結合的污染物，從而降低污染物的生物有效性、減少生物積累和生態毒性[2-3]。

生物炭是一種重要的新型碳材料，目前被認為是一種重要的綠色環境吸附劑，在環境修復中發揮重要的作用[4]，因此，將生物炭應用于污染沉積物的原位修復具有很大的潛力[5-9]。關于生物炭對水土環境中污染物阻控的研究主要關注污染物的生物有效性[10-11]，但在判斷生物炭對污染沉積物的修復效力時僅依據污染物生物有效性的變化往往是不夠的，必須同時結合生物效應進行綜合評判，因為污染物的生態毒性風險只有通過生物效應才能得以體現。目前，關于生物炭對污染物生態毒性風險影響的評價研究尚較少報道[12-13]。銅銹環棱螺(Bellamyaaeruginosa)是屬于腹足綱田螺科的淡水軟體動物，在我國淡水環境中廣泛分布，是一種典型的沉積物棲居型底棲動物，該物種對一些典型重金屬和持久性有機污染物表現出較好的敏感性，是進行沉積物毒性測試的理想生物[14-15]。

多溴聯苯醚(PBDEs)是典型的持久性有機污染物，PBDEs主要用作阻燃劑，在眾多的PBDEs同系物中，2,2’,4,4’-四溴聯苯醚(BDE-47)約占PBDEs總量的70%，也是毒性最強的[16]。PBDEs具有高脂溶性，在沉積物中的濃度通常高于水相。例如，我國珠江沉積物中PBDEs的濃度為12.7～7 361 ng·g-1，水相中濃度為108～5 788 ng·L-1 [17]。

本研究以玉米秸稈制備的生物炭(corn straw biochar, CSB)為研究對象，以BDE-47為目標污染物，以銅銹環棱螺為測試生物，采用28 d沉積物生物測試的方法，研究在BDE-47加標沉積物中添加不同比例CSB的情況下，BDE-47在銅銹環棱螺體內的生物積累、對其肝胰臟細胞DNA損傷以及螺體內氧化脅迫關鍵生物標志物(活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)和丙二醛(MDA)隨時間的動態變化，考察CSB自身的毒性和CSB對沉積物中BDE-47生態毒性控制的效果。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

主要儀器：真空氣氛爐(GR.TF 80/11，上海貴爾機械設備有限公司)；比表面及孔徑分析儀(美國麥克三站全功能型多用吸附儀3Flex，美國麥克儀器公司)；熱場發射掃描電子顯微鏡(Quanta 400 FEG，美國FEI公司)；氣相色譜-質譜聯用儀(GC/MS-QP2010 plus，日本Shimadzu儀器公司)；熒光顯微鏡(ECLIPSE 80i，日本尼康公司)；多功能酶標儀(DTX-880，美國Beckman Coulter公司)；臺式高速冷凍離心機(TGL-16M，長沙平凡儀器儀表有限公司)；水平電泳儀(DYY-12型，北京六一儀器廠)；旋轉蒸發儀(KE-2000E，上海亞榮儀器有限公司)；玻璃勻漿器；玻璃層析柱。

主要試劑：2,2’,4,4’-四溴聯苯醚(BDE-47)，分子式C12H6Br4O，CAS# 5436-43-1，純度98.5%，BDE-47標樣(50 μg·mL-1)購自AccuStandard公司；定量內標13C12-PCB138(40 μg·mL-1)購自美國劍橋同位素實驗室；正壬烷、異辛烷購自上海阿拉丁生化科技公司，均為GCS級；蔗糖、Tris、EDTA-2Na、2,4-二硝基苯肼(DNPH)和鹽酸胍為國產分析純；正己烷、二氯甲烷、丙酮和甲醇為國產農藥殘留級。

1.2 試驗材料

1.2.1 測試生物

采用實驗室人工培養的銅銹環棱螺作為測試生物[13]，選取個體大小一致的健康成體，殼長為(18.10±1.14) mm，體重為(1.56±0.15) g，用于沉積物暴露測試。

1.2.2 沉積物

實驗所用沉積物來自湖南吉首市德夯自然保護區，采集與處理方法見Ma等[14]的報道。

1.2.3 玉米秸稈生物炭制備與表征

CSB采用高純氬氣保護炭化法進行制備。先將玉米秸稈置于烘箱中烘干，粉碎后裝填在管式真空氣氛爐的石英爐管中。炭化前，先對爐管抽真空，然后通入高純氬氣，重復3次后，持續通入氬氣，待管內壓力高于1.5個標準大氣壓后，打開排氣口，控制出氣量，使管內壓力在整個炭化過程中不低于1個標準大氣壓。根據預實驗結果設定炭化溫度為500 ℃，炭化時間為8 h。將所制得的生物炭用去離子水反復淋洗至浸出水呈中性，然后于85 ℃烘干至恒重，取出研磨，過150 μm尼龍篩，保存備用。經分析，在生物炭樣品中未檢測到BDE-47。對測試用生物炭樣品采用比表面及孔徑分析儀測定其比表面積、平均吸附孔徑和外部表面積等表面參數，同時采用熱場發射掃描電子顯微鏡(SEM)進行表征。

1.3 沉積物生物測試

根據我國水體沉積物中BDE-47的環境相關水平設定BDE-47的實驗加標濃度為500 ng·g-1干重[17]。將生物炭設置3個添加水平(w/w)：1%、4%和7%。實驗共設8個處理組(表1)，用于測試CSB自身的毒性(處理1～4)和CSB與BDE-47聯合暴露的毒性(處理5～8)，每個處理組設3個重復。

表1 實驗設計Table 1 Experimental set-up

注：CSB表示以玉米秸稈制備的生物炭；-表示無添加。

Note: CSB stands for corn straw biochar; - means no addition.

參考王萌等[18]的方法對沉積物進行加標處理。首先為每個處理組稱取2 100 g干沉積物(預先過150 μm尼龍篩)，按上述實驗設計加入相應質量的CSB到每個處理組的沉積物中，然后分別倒入攪拌機中連續攪拌至少1 h，轉入塑料小桶中。按沉積物和去離子水1∶1的體積比加入去離子水，充分攪拌至混合均勻。用二甲基亞砜(DMSO)配制濃度為5 mg·mL-1的BDE-47儲備液，在需要添加BDE-47的處理組加入相應質量的BDE-47儲備液。每隔3 h用潔凈小木鏟攪拌一次，一次持續1 h，24 h后完成攪拌。加標沉積物在室溫下靜置14 d，在存貯期間，每隔3 d再充分攪拌一次，使加標沉積物達到理化平衡[19]。將每組處理好的沉積物均分到3個重復測試缸(4 L)中，按沉積物與上覆水1∶4的體積比加入去離子水，然后將所有測試缸置于一個水浴控溫水槽中，靜置3 d。暴露開始時，將所選實驗螺隨機分組，放入每個測試缸中，每個測試缸15只，每個處理組共有實驗螺45只，保持光照周期為12 h(白晝)∶12 h(黑暗)，水溫(24±1) ℃，以靜水充氣的方式暴露28 d，對每個測試缸加蓋尼龍網，中間留一個直徑為5 cm的圓孔，方便喂食。按每只螺每天5 mg的量投喂食料[14]。在整個暴露期間，每個測試缸中實驗螺的存活率都在90%以上，符合沉積物毒性測試標準要求。在暴露7、14、21和28 d時取樣，分3批進行，首先從每個處理組中取實驗螺3只，清洗干凈，用鉗子夾破螺尖，取出肝胰臟，立即進行DNA損傷測定；然后再從每個處理組中取實驗螺3只，分離出肝胰臟置于液氮中速凍保存用于生化測定；最后從每個處理組中取實驗螺3只放入裝有去離子水的潔凈玻璃缸中清腸24 h(以消除腸道中存留的BDE-47對BDE-47生物積累的影響)，然后分離出全部的內臟團，保存于-20 ℃冰箱中，用于BDE-47的分析。在暴露實驗開始前，對未經暴露的螺進行同樣的取樣處理和測定。此外，在暴露7、14、21和28 d時，對每個測試缸進行沉積物取樣(50 g)，于2 500 r·min-1離心，過濾，用于測定沉積物間隙水中BDE-47的濃度。

1.4 DNA損傷測定

采用彗星實驗法(comet assay)[20]檢測肝胰臟細胞DNA損傷的程度，按照Ma等[21]建立的操作方法進行DNA損傷測定，用熒光顯微鏡進行彗星圖像采集，采用CASP軟件進行圖像數據分析，獲取Olive尾距(Olive tail moment, OTM)，OTM為彗星頭部重心與尾部重心間距離與彗尾DNA含量的乘積，對每個處理組檢測3個樣本，每個樣本觀察1張載玻片，取50個細胞數據的中位數作為DNA損傷測定值。

1.5 生化測定

1.5.1 ROS的測定

利用熒光探針DCFH-DA對新鮮肝胰臟中ROS的含量進行測定。將肝胰臟組織和100 mmol·L-1的磷酸緩沖液(PBS)按質量(g)體積(mL)比1∶20的比例加入到玻璃勻漿器中，冰浴下制成勻漿，然后轉入0.5 mL離心管，于4 ℃、1 200 r·min-1，離心10 min。先取190 μL上清液加入到黑底酶標板中，加入10 μL 1 mmol·L-1的DCFC-DA熒光探針；再取190 μL上清液加入到另一黑底酶標板中，加入10 μL PBS，吹打均勻后，于37 ℃孵育30 min，在多功能酶標儀上測定熒光強度(激發波長(500±15) nm；發射波長(530±20) nm)。最后取部分剩余上清液采用考馬斯亮藍法在595 nm下測定蛋白含量，ROS含量以熒光強度值(FI)·mg-1蛋白表示。

1.5.2 SOD、GST和MDA的測定

按照龍奕等[22]的方法進行組織樣品的制備和指標的測定。先將冷凍的肝胰臟組織和0.01 mol·L-1Tris-HCl勻漿介質(pH 7.4)按質量(g)體積(mL)比1∶9的比例加入到玻璃勻漿器中，冰浴下制成勻漿，然后轉入0.5 mL離心管，于4 ℃、2 500 r·min-1，離心10 min。先取上清液20 μL(即10%勻漿上清液)，用勻漿介質稀釋到1%，用于測SOD活性；再取上清液220 μL，用于測GST活性；剩余的勻漿液在10 000 r·min-1繼續離心20 min，取上清液，稀釋到1%，用于測定MDA含量。SOD活性采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化還原法測定，在550 nm下測吸光度，以50%抑制率的酶量為1個SOD的活力單位(U·mg-1蛋白)；GST活性采用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)法測定，在340 nm下測吸光度，活力單位以U·mg-1蛋白表示；MDA含量采用硫代苯巴比妥酸(TBA)比色法測定，在532 nm下測定吸光值，活力單位以nmol·mg-1蛋白表示；采用考馬斯亮藍染色法在595 nm下測定蛋白含量。

1.6 內臟團中BDE-47的分析測定

按照劉佳等[23]的方法對冷凍保存的內臟團樣品和間隙水樣進行前處理。以PCB-209作為回收率指示物標樣，以13C12-PCB138作為定量內標。在GC/MS上采用程序升溫的方法進行測定。色譜柱升溫程序為初始溫度110 ℃保持1 min，8 ℃·min-1升溫至180 ℃保持1 min，以2 ℃·min-1升溫至240 ℃保持5 min，以2 ℃·min-1升溫到280 ℃保持6 min。質譜條件：采用EI離子源進行電離，離子源溫度為230 ℃，電子能量70 eV，燈絲電流0.7 mV，離子掃描模式為SIM模式，接口溫度為300 ℃。全過程采用方法空白、加標空白、基質加標和基質加標平行樣進行質量控制。樣品中PCB-209的加標回收率為71%～96%，在合理的回收率范圍(60%～120%)內，符合分析要求。儀器對BDE-47的檢測限為1.08 ng·mL-1。采用內標法和校正因子對BDE-47進行定量分析計算。

1.7 數據處理與統計分析

實驗數據采用SPSS20.0進行統計分析。對實驗數據先進行正態分布檢驗，然后利用單因素方差分析法(ANOVA)和多重比較檢驗法(LSD)進行組間差異顯著性檢驗，差異顯著性水平為0.05。

2 結果(Results)

2.1 生物炭表征

對CSB進行了表面積和孔徑測定，結果顯示，CSB的比表面積和外部表面積分別為81.66和115.17 m2·g-1，平均吸附孔徑為3.874 nm。CSB的掃描電鏡照片顯示，其外部形貌呈片層狀或者柱狀，孔隙度較高(圖1)。

2.2 沉積物間隙水中BDE-47的濃度

暴露實驗前和不同取樣時間點沉積物間隙水中BDE-47濃度的變化如表2所示。在對照組和生物炭單獨處理組中均未檢測到BDE-47。在BDE-47單獨處理組和CSB與BDE-47聯合處理組，暴露21 d后，間隙水中BDE-47的濃度有所下降，但差異不顯著，說明在暴露實驗過程中生物擾動對沉積物化學特性的影響可以忽略不計。與BDE-47單獨處理組相比，CSB與BDE-47聯合處理組間隙水的BDE-47濃度均顯著下降，比較暴露28 d后的情況可以看出，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組BDE-47的濃度分別比BDE-47單獨處理組下降了52%、71%和81%。

圖1 玉米秸稈生物炭(CSB)的掃描電鏡照片Fig. 1 Scanning electron micrograph of corn straw biochar (CSB)

2.3 CSB對銅銹環棱螺的毒性

將銅銹環棱螺暴露于單獨添加不同比例CSB的沉積物28 d后，結果表明，與對照組相比，各處理組銅銹環棱螺肝胰臟DNA損傷(OTM值)、活性氧(ROS)水平、SOD活性、GST活性和MDA含量均未表現出顯著差異，說明CSB對銅銹環棱螺不具有毒性。

2.4 CSB和BDE-47聯合暴露對銅銹環棱螺肝胰臟中BDE-47生物積累的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對銅銹環棱螺內臟團中BDE-47含量的影響如圖2所示。隨暴露時間的延長，不同處理組的BDE-47含量總體上呈上升趨勢，添加不同比例的CSB能明顯降低BDE-47的生物積累。在暴露后期(21和28 d)，4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組的BDE-47含量不再隨暴露時間的增加而升高。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組的BDE-47含量分別比BDE-47單獨處理組(969.94 ng·g-1)下降了50%、69%和79%。

2.5 CSB和BDE-47聯合暴露對肝胰臟細胞DNA損傷的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對銅銹環棱螺肝胰臟DNA損傷(OTM值)的影響如圖3所示。除暴露初期(7 d)外，CSB與BDE-47聯合處理組的OTM值均顯著低于BDE-47單獨處理組，且隨著暴露時間的延長和CSB比例的增加，CSB與BDE-47聯合處理組的OTM值顯著降低。在暴露后期(21和28 d)，7% CSB與BDE-47聯合處理組的OTM值不再隨暴露時間的增加而升高。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組的OTM值分別比BDE-47單獨處理組(20.67)下降了44%、67%和83%。

圖2 CSB和BDE-47單一或復合加標沉積物暴露后銅銹環棱螺內臟團中BDE-47含量的變化注：不同字母表示處理組間存在顯著性差異，P < 0.05；下同。Fig. 2 The change of BDE-47 burden in the visceral mass of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSBNote: Different letters show statistically significant differences between treatment groups, P < 0.05, the same below.

表2 沉積物間隙水中BDE-47的濃度(平均值±SD, n=3)Table 2 The concentration of BDE-47 in the porewaters of the sediments (mean±SD, n=3)

注：同一列數據后英文小寫字母不同表示不同處理組之間差異顯著(P<0.05)；ND表示未檢出。

Note: Different lowercase letters in the same column of data represent significant differences between different treatment groups (P<0.05); ND is not detected.

圖3 CSB和BDE-47單一或復合加標沉積物暴露后銅銹環棱螺肝胰臟DNA損傷的變化Fig. 3 The change of DNA damage in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

2.6 CSB和BDE-47聯合暴露對肝胰臟細胞ROS水平的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對銅銹環棱螺肝胰臟ROS水平的影響如圖4所示。除暴露初期(7 d)外，CSB與BDE-47聯合處理組的ROS水平均顯著低于BDE-47單獨處理組。4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組的ROS水平顯著低于1% CSB與BDE-47聯合處理組，但4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組之間沒有顯著差異。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組的ROS水平分別比BDE-47單獨處理組(70.71)下降了29%、40%和41%。

2.7 CSB和BDE-47聯合暴露對肝胰臟細胞SOD活性的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對銅銹環棱螺肝胰臟SOD活性的影響如圖5所示。在暴露初期(7 d)，CSB的影響不明顯；暴露14 d后，CSB與BDE-47聯合處理組的SOD活性顯著低于BDE-47單獨處理組；在暴露后期(21和28 d)，CSB與BDE-47聯合處理組的SOD活性總體上顯著高于BDE-47單獨處理組。在整個暴露期內，4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組之間沒有顯著差異。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組的SOD活性分別比BDE-47單獨處理組(13.08 U·mg-1蛋白)升高了9%、17%和21%。

圖4 CSB和BDE-47單一或復合加標沉積物暴露后銅銹環棱螺肝胰臟活性氧(ROS)含量的變化注：FI表示熒光強度。Fig. 4 The change of reactive oxygen species (ROS) levels in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSBNote: FI stands for fluorescence intensity.

圖5 CSB和BDE-47單一或復合加標沉積物暴露后銅銹環棱螺肝胰臟超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化Fig. 5 The change of superoxide dismutase (SOD) activities in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

2.8 CSB和BDE-47聯合暴露對肝胰臟細胞GST活性的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對銅銹環棱螺肝胰臟GST活性的影響如圖6所示。GST活性隨時間的變化規律與SOD活性基本相同。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組的GST活性分別比BDE-47單獨處理組(31.68 U·mg-1蛋白)升高了89%、80%和83%。

圖6 CSB和BDE-47單一或復合加標沉積物暴露后銅銹環棱螺肝胰臟谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)活性的變化Fig. 6 The change of glutathione-S-transferase (GST) activities in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

2.9 CSB和BDE-47聯合暴露對肝胰臟細胞MDA含量的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對銅銹環棱螺肝胰臟MDA含量的影響如圖7所示。除暴露初期(7 d)外，CSB與BDE-47聯合處理組的MDA含量均顯著低于BDE-47單獨處理組，但1%、4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組之間沒有顯著差異。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯合處理組的MDA含量分別比BDE-47單獨處理組(2.52 nmol·mg-1蛋白)下降了66%、71%和72%。

圖7 CSB和BDE-47單一或復合加標沉積物暴露后銅銹環棱螺肝胰臟丙二醛(MDA)含量的變化Fig. 7 The change of malondialdehyde (MDA) levels in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

3 討論(Discussion)

3.1 生物炭的潛在生態毒性風險

目前，關于生物炭生態毒性風險的研究已有一些報道。一些研究指出，生物炭具有較低的毒性[24-25]。另有一些研究表明，生物炭不具有毒性，例如，Busch等[26-27]的研究表明水熱法制備的生物炭對蚯蚓沒有毒性；韓杰等[28]的研究表明水稻秸稈生物炭對小鼠不具有毒性。已有研究表明，生物炭的毒性主要與制備工藝和處理方法有關，相對較高溫度下(>400 ℃)慢速熱解制備的生物炭通常不具有毒性[29-32]；酸化處理可以降低生物炭的毒性風險[33]。在本研究中CSB都是在較高裂解溫度(500 ℃)下制備的，而且在暴露實驗前都經過酸洗處理，因此不具有毒性。此外，生物炭的毒性還與測試生物種類有關[34]。

3.2 生物炭對沉積物或土壤中有機污染物生物積累的影響

有研究表明，在沉積物或土壤中添加生物炭可以降低有機污染物的生物積累，而且與生物炭的添加量有關。Shen等[5]在研究中指出，當沉積物中玉米秸稈和馬尾松生物炭的添加量<1.5%時，搖蚊幼蟲體內多環芳烴的生物積累顯著降低，但當生物炭添加量>1.5%時，對多環芳烴的生物積累沒有影響；Xia等[6]發現玉米秸稈和柳樹生物炭可以顯著降低沉積物中全氟辛烷磺酸在搖蚊幼蟲體內的生物積累，并且生物炭用量(0.2%～1.5%)越高，生物積累降低越多。Wang等[35]在研究中指出，松木生物炭(400 ℃)雖然能顯著降低土壤中阿特拉津在2種蚯蚓體內的生物積累，但當生物炭添加量為0.5%時，阿特拉津在威廉腔環蚓(Metaphireguillelmi)體內的生物積累低于赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)，而當生物炭用量為2%時，阿特拉津在2種蚯蚓體內的生物積累沒有差異。本研究顯示，在沉積物中添加CSB(500 ℃)能顯著降低BDE-47在銅銹環棱螺體內的生物積累，而且在實驗范圍內CSB添加比例越高，效果越顯著。因此，生物炭對沉積物或土壤中有機污染物生物積累影響的差異與污染物的種類和濃度、生物炭的制備條件、種類和添加水平以及測試生物的種類有關[13]。本研究還顯示，隨著CSB添加比例的增加，沉積物間隙水中BDE-47的濃度顯著下降，從而導致BDE-47的生物積累顯著減少，因此，BDE-47的生物積累與沉積物間隙水中BDE-47的濃度成正相關，這與Xia等[6]的研究結果基本一致。

3.3 生物炭對沉積物或土壤中有機污染物生態毒性的影響

目前，有關生物炭與沉積物或土壤中有機污染物相互作用后對底棲動物或土壤動物的潛在生態毒性風險的評價研究僅有少量報道。Bielská等[36]研究了土壤中芒草生物炭與芘相互作用對秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的影響，結果顯示生物炭可以顯著降低芘對秀麗隱桿線蟲的生態毒性。Bielská等[12]又進一步研究了土壤中木屑和稻殼生物炭與芘、多氯聯苯(PCB-52)和p,p’-滴滴伊(p,p’-DDE)相互作用對跳蟲(Folsomiacandida)的影響，結果表明，添加生物炭(1%～5%)可以降低這些有機污染物對跳蟲的繁殖毒性。本研究通過考察銅銹環棱螺的DNA損傷以及氧化脅迫相關生物標志物的變化來反映沉積物中CSB對BDE-47生態毒性的影響。細胞DNA損傷和氧化脅迫的生物標志物通?？梢杂行е甘疚廴疚锏纳鷳B毒性[13,22]。當生物機體受到外源性化學物質脅迫時，作為機體抗氧化防御系統重要組分的SOD可以降低或消除氧化脅迫以維持ROS的平衡，但過多的ROS則會激活或抑制SOD活性；MDA水平是衡量機體脂質過氧化程度和細胞氧化損傷的程度；GST是一種在機體Ⅱ代謝中參與親電性化合物解毒的關鍵酶，它同時也參與細胞的抗氧化防御，污染脅迫時GST活性的改變體現了機體對污染物的生物轉化和抗氧化功能；機體細胞DNA在ROS的攻擊下容易發生氧化損傷。結果表明，沉積物中不同比例的CSB與BDE-47的聯合暴露能夠顯著降低銅銹環棱螺肝胰臟的DNA損傷和ROS水平，顯著減少對SOD和GST活性的抑制，顯著降低MDA含量，這說明不同添加比例的CSB均可以顯著降低BDE-47對銅銹環棱螺的毒性，較高比例(4%和7%)CSB的效果更為顯著。從變化趨勢來看，DNA損傷隨著CSB添加比例的升高而顯著降低，但不同添加比例的CSB與BDE-47聯合處理組之間的ROS水平、SOD活性、GST活性和MDA含量沒有顯著差異，也就是說，BDE-47的氧化脅迫毒性不隨CSB添加比例的升高而下降，這可能是由于不同CSB添加比例引起的聯合處理組中BDE-47生物積累的差異并不足以引起氧化脅迫生物標志物響應的改變，這與銅銹環棱螺對BDE-47脅迫的響應相對較慢有關[15]。

綜上所述，在慢性暴露情況下，本研究所制備的CSB對銅銹環棱螺不具有毒性。CSB通過顯著降低沉積物間隙水中BDE-47的濃度而降低其在銅銹環棱螺體內的生物積累，在實驗濃度范圍內(1%～7%)，CSB添加比例越高，降低BDE-47生物積累的效果越顯著。不同添加比例的CSB均可以顯著降低BDE-47對銅銹環棱螺的毒性(DNA損傷)，較高比例(4%和7%)CSB的效果更為顯著，但BDE-47的氧化脅迫毒性不隨CSB添加比例的升高而下降。因此，從降低沉積物中BDE-47生態毒性風險的角度來說，沉積物中CSB的合適添加比例為4%。