喬松素對內質網應激所致內皮細胞凋亡的抑制作用及機制*

于 飛，田 華，盧 珊，郭亞新，王曉旭，，焦 鵬，宗傳龍，姚樹桐，△，秦樹存△

[山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）1基礎醫學院，2動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室，3生命科學學院，山東泰安27100]

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多種細胞介導下的慢性炎癥性病理過程，作為心腦血管疾病的主要病理基礎，嚴重危害人類的健康。血管內皮細胞、平滑肌細胞、單核/巨噬細胞等均參與AS的發生發展，其中血管內皮細胞損傷和凋亡是AS發病的始動環節，因此保護血管內皮細胞對于AS的防治具有重要意義[1]。有研究表明，攝入富含黃酮類食物的量與AS的發生率和死亡率呈負相關，其中蜂膠黃酮具有廣泛的抗AS功能[2]。

喬松素（pinocembrin）是一種存在于植物和蜂膠中含量較高的黃酮類天然化合物，具有抗菌、抗原蟲、抗氧化、抗凋亡等多種藥理學活性。另有研究表明，辛伐他汀和喬松素聯合治療ApoE-/-小鼠14周可顯著降低小鼠血清脂質水平，改善內皮細胞功能，減輕AS病變，并且聯合療法的療效優于單用辛伐他汀[3]，且單獨應用喬松素可使ApoE-/-小鼠AS斑塊面積縮小，降低血清中和斑塊內血管內皮生長因子的水平，并具有防止斑塊破裂和穩定斑塊的作用[4]。喬松素可減輕脂多糖誘導的內皮細胞凋亡，其機制可能與抑制核因子κB p65活化有關[5]。大量研究證實內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）信號途徑介導AS的發生發展尤其是易損性斑塊的形成[6-8]。ERS凋亡途徑在棕櫚酸和氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）誘導的血管內皮細胞凋亡中具有重要作用[9-10]。本課題組既往研究證實，蜂膠醇提物可通過抑制ERS凋亡途徑關鍵分子C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的表達減輕ox-LDL誘導的血管內皮細胞凋亡[11]，但是蜂膠醇提物中發揮細胞保護作用的有效成分及其調控CHOP的上游分子機制尚未被完全闡明。本研究在ERS誘導劑衣霉素（tunicamycin，TM）誘導的人臍靜脈內皮細胞（human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs）損傷模型上，探討喬松素對CHOP表達、CHOP上游調控蛋白——蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和真核翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）磷酸化水平及活化轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）核轉位的影響，以進一步明確蜂膠黃酮抗AS的有效成分并深入探討其對內皮細胞凋亡的調控作用及機制。

材料和方法

1 主要試劑

喬松素、TM和小鼠抗β-actin抗體購自Sigma；MTT購自 Genview；Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡測定試劑盒和Hoechst 33342/PI雙染試劑盒分別購自南京凱基和南京建成公司；RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購自Solarbio；兔抗葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、ATF6、p-PERK、p-eIF2α 和CHOP多克隆抗體及AlexaFluor 488標記的驢抗兔II抗購自Cell Signaling Technology、Sigma和Invitrogen；DAPI和辣根過氧化物酶標記的II抗分別購自上海碧云天和北京中杉金橋公司；ECL試劑盒和PVDF膜分別購自Pierce和Millpore。

2 方法

2.1 細胞培養與實驗分組 HUVECs由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫提供，用DMEM培養液（含10%FBS+1×105U/L青霉素+100 mg/L鏈霉素）在37℃、5%CO2的培養箱中培養。處理前換無血清培養液同步化12 h，然后參照文獻報道及本課題組的預實驗結果隨機分為如下3組：（1）正常對照（control）組：培養液中常規培養；（2）TM組：培養液中加入10 mg/L的TM[12]；（3）喬松素干預（pinocembrin）組：分別在培養液中先加入6.25、12.5、25 和 50 mg/L[13]喬松素預處理 1 h，再加入 10 mg/L的TM。培養24 h后收集細胞。

2.2 細胞活力和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的測定 接種于96孔板的細胞按照上述分組處理后，按既往報道的MTT法[13]檢測細胞活力。以正常對照組細胞活力為100%，其余各組細胞活力以其吸光度（A）值占對照組A值的百分比表示。培養液中LDH活性檢測按照試劑盒說明進行。

2.3 Hoechst 33342/PI雙染色熒光顯微鏡觀測細胞死亡情況 接種細胞于放有無菌蓋玻片的6孔培養板中，經處理后吸棄培養液，將100倍稀釋的Hoechst 33342染色液加到細胞爬片上，37℃避光孵育15 min；PBS潤洗后將200倍稀釋的PI染色液加到爬片上，室溫避光孵育10 min；PBS潤洗后抗淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡（Olympus）下觀察（Hoechst 33342激發光波長352 nm，呈藍色；PI激發光波長488 nm，呈紅色）。PI陽性率（%）=紅色細胞數/藍色細胞數×100%。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測 細胞接種于6孔培養板內經相應處理后，用胰酶消化，100×g離心5 min，棄上清，收集細胞并重懸于500 μL上樣緩沖液中，加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，輕微搖勻后，室溫避光孵育15 min，隨即在流式細胞儀（Becton Dickinson）上檢測?？偧毎蛲雎剩?）=早期凋亡率（Annexin+/PI－）+晚期凋亡率（Annexin+/PI+）。

2.5 免疫熒光細胞化學法檢測ATF6核轉位情況 細胞接種于放有無菌蓋玻片的6孔培養板內，處理后經PBS潤洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS潤洗后以0.1%Triton X-100室溫透化5 min，以10%驢血清封閉30 min，滴加兔抗人ATF6抗體（1∶100），4℃孵育過夜，PBS潤洗后滴加Alexa Fluor 488標記的驢抗兔IgG（1∶500），37℃避光孵育30 min，再以DAPI復染細胞核（藍色）5 min，PBS充分潤洗后以抗淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察，細胞核呈藍色，ATF6呈綠色。

2.6 Western blot分析 采用RIPA試劑提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。調整蛋白濃度一致后進行SDS-PAGE分離，電轉至PVDF膜后室溫封閉，分別加入兔抗 p-PERK（1∶200）、p-eIF2α（1∶200）、GRP78（1∶500）和CHOP（1∶500）多克隆抗體及小鼠抗β-actin（1∶1 000）多克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入Ⅱ抗（1∶2 000）孵育2 h，經化學顯色底物ECL進行發光顯示，應用化學發光成像系統（上海歐翔科學儀器有限公司）進行圖像采集。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件（Version 6.0，Media Cybernetics）分析蛋白條帶積分吸光度（integral absorbance，IA），以靶蛋白IA/β-actinIA的比值反映靶蛋白相對水平。

3 統計學處理

結果用均數±標準差（mean±SD）表示。采用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析，組間兩兩比較應用SNK法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 喬松素抑制TM所致的HUVECs活力降低

用 6.25、12.5、25和 50 mg/L的喬松素處理HUVECs 24 h，與正常對照組相比，6.25、12.5和25 mg/L喬松素處理組細胞活力無顯著改變（P＞0.05），而50 mg/L喬松素處理組細胞活力顯著降低（P＜0.05），表明劑量為6.25～25 mg/L的喬松素對細胞無毒性作用，見圖1A。與對照組相比，TM處理細胞24 h后細胞活力顯著降低（P＜0.01），然而給予喬松素預處理1 h，細胞活力較TM組顯著增加，尤其以12.5和25 mg/L喬松素處理組更為顯著（P＜0.05或P＜0.01），見圖1B。

2 喬松素抑制TM所致的HUVECs膜損傷

TM組細胞LDH漏出顯著增加（P＜0.01），而喬松素（12.5和25 mg/L）預處理組LDH漏出較TM組顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），見圖 2A。Hoechst 33342/PI雙染法觀察細胞形態，TM組細胞膜通透性增加甚至破裂，從而允許PI穿過細胞膜至核內與DNA結合，細胞核紅色熒光陽性細胞增加（P＜0.01），而喬松素（12.5和25 mg/L）預處理組細胞膜損傷減輕，表現為細胞核紅色熒光陽性細胞數顯著減少（P＜0.01），見圖2B。

3 喬松素減輕TM所致的HUVECs凋亡

流式細胞術結果顯示，TM組細胞凋亡率顯著增加，為對照組的4.3倍（P＜0.01）；與TM組比較，12.5和25 mg/L的喬松素預處理組細胞凋亡率分別降低15.3%和22.1%（P＜0.05和P＜0.01），見圖3。

4 喬松素抑制TM所誘導的HUVECs內GRP78和CHOP上調

與對照組相比，TM組GRP78和CHOP表達顯著升高（P＜0.01），而喬松素（12.5和25 mg/L）預處理可顯著抑制TM所誘導的GRP78和CHOP上調（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。

5 喬松素抑制TM所致的HUVECs內ATF6核轉位

Figure 2.Effect of pinocembrin on TM-induced membrane damage in HUVECs.The cells were pretreated with the indicated doses of pinocembrin for 1 h，and then stimulated with TM（10 mg/L）for 24 h.The degree of cell membrane damage was determined by LDH activity in media（A）and Hoechst 33342（blue）/PI（red）double-staining assay（B）.Images were captured using a laser scanning confocal microscope，and PI-positive cells in 5 randomly chosen fields each containing about 100 cells were quantified（scale bar=20 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs TM group.圖2 喬松素對TM所致的HUVECs膜損傷的影響

采用免疫熒光染色法顯示ATF6核轉位情況，對照組綠色熒光主要分布于細胞漿，而核內很少或者無表達；TM組細胞核內出現強綠色熒光染色；而與TM組相比，喬松素（12.5和25mg/L）預處理組的細胞核內綠色熒光強度顯著降低，見圖5。

Figure 3.Effect of pinocembrin on TM-induced apoptosis of HUVECs.The cells were pretreated with 12.5 and 25 mg/L of pinocembrin for 1 h，and then treated with TM（10 mg/L）for 24 h.The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining，and the total apoptotic rates（early-and late-stage apoptosis）were calculated.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TM group.圖3 喬松素對TM所致HUVECs凋亡的影響

Figure 4.Effect of pinocembrin on the protein expression of GRP78 and CHOP in TM-treated HUVECs.The cells were treated as described in Figure 3.The protein expression levels of GRP78 and CHOP were detected by Western blot.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TM group.圖4 喬松素對TM所致的HUVECs內GRP78和CHOP表達的影響

6 喬松素抑制TM所致的HUVECs內PERK和eIF2α磷酸化

與對照組相比，TM處理組p-PERK和p-eIF2α水平顯著升高（P＜0.01），而喬松素（12.5和25 mg/L）預處理可顯著減輕PERK和eIF2α的磷酸化水平（P＜0.05或P＜0.01），見圖6。

討 論

血管內皮細胞損傷及功能紊亂是AS發生發展的始動環節，ox-LDL、晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）和異常血流剪切應力等多種病理性致AS因素均可誘導ERS介導的內皮細胞凋亡，因此減輕ERS介導的血管內皮細胞凋亡被認為是AS防治的重要措施[14-16]。既往對喬松素的研究表明，其具有抗氧化、抗炎和神經保護作用[17]。對于心血管疾病的研究表明喬松素可使ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積縮小，也可降低血清中和斑塊內血管內皮生長因子及內皮素的水平，對斑塊產生有抑制作用，同時還具有防止斑塊破裂和穩定斑塊的作用[3-4]，但其具體細胞分子機制尚待進一步闡明。本研究結果顯示，給予ERS誘導劑TM處理HUVECs 24 h，細胞活力顯著降低，細胞膜損傷程度和凋亡率顯著增加，與文獻報道[12，18]一致。而給予喬松素預處理可顯著抑制TM所誘導的HUVECs損傷，表現為細胞活力增加，細胞膜損傷程度和凋亡率降低，且呈濃度依賴性。這些結果提示喬松素可減輕HUVECs損傷，其機制可能與抑制ERS介導的凋亡途徑有關。

Figure 5.Effect of pinocembrin on ATF6 nuclear translocation in HUVECs induced by TM.The cells were treated as described in Figure 3.Immunofluorescence experiments showed ATF6 visualized by Alexa Fluor 488（green）and nuclei stained with DAPI（blue）.The representative fluorescence images were captured by a laser scanning confocal microscope（scale bar=20 μm）.圖5 喬松素對TM所致HUVECs內ATF6核轉位的影響

Figure 6.Influence of pinocembrin on the phosphorylation levels of PERK and eIF2α in TM-treated HUVECs.The cells were treated as described in Figure 3.The protein levels of p-PERK and p-eIF2α were detected by Western blot.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TM group.圖6 喬松素對TM所致的HUVECs內PERK和eIF2α磷酸化水平的影響

既往研究證實，抑制炎癥反應是喬松素發揮其細胞保護作用的重要機制。喬松素在脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥模型中可抑制核因子κB以及細胞外信號調節激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶和p38絲裂原激活蛋白激酶的磷酸化，進而調節腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β、白細胞介素6、白細胞介素10等細胞因子的分泌[19]。蜂膠醇提物和喬松素均可抑制脂多糖誘導的巨噬細胞凋亡和基質金屬蛋白酶9基因表達及活性[20]。另有研究表明喬松素可通過抑制核因子κB和p38絲裂原激活蛋白激酶信號通路介導的炎癥因子的釋放減輕脂多糖和ox-LDL誘導的內皮細胞損傷和凋亡[5，21]。內質網也是損傷感知或凋亡信號整合的主要位點，且過度的ERS可介導細胞凋亡，在動脈粥樣硬化發生發展中發揮著重要作用。CHOP又稱生長停滯和DNA損傷蛋白153，是介導ERS相關凋亡途徑的關鍵分子之一[22]。CHOP介導的巨噬細胞和血管內皮細胞凋亡參與AS進展尤其是不穩定AS粥樣斑塊的形成[23-24]。本課題組前期工作證實ox-LDL、氧化和糖基化高密度脂蛋白均可通過激活CHOP介導的ERS凋亡途徑誘導巨噬細胞凋亡[25-27]，而蜂膠提取物及其黃酮單體槲皮素可通過抑制氧化應激，下調CHOP表達從而減輕ox-LDL誘導的巨噬細胞和血管內皮細胞凋亡[11，28-29]，這些結果表明CHOP介導的ERS凋亡途徑參與AS發生發展，并可能成為AS防治靶點，但是喬松素對CHOP介導的血管內皮細胞凋亡是否具有抑制作用尚未見文獻報道。本實驗結果顯示，ERS誘導劑TM可上調HUVECs內ERS標志分子GRP78和促凋亡蛋白CHOP的表達水平，而喬松素可顯著拮抗兩者的上調，表明喬松素可通過抑制CHOP信號通路減輕HUVECs凋亡。

CHOP主要受PERK-eIF2α-ATF4通路調控，也可被ATF6和肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1，IREl）上調轉錄水平[22]。本課題組前期工作證實PERK和ATF6可介導ox-LDL和氧化高密度脂蛋白所誘導的巨噬細胞凋亡[25，27]，而蜂膠醇提物可通過抑制PERK-eIF2α-CHOP信號通路減輕ox-LDL和TM誘導的巨噬細胞凋亡[30]。本實驗結果顯示，TM處理組可上調PERK和eIF2α的磷酸化以及ATF6核轉位，而喬松素則顯著逆轉TM所致的上述變化，并呈劑量依賴性，說明喬松素可以通過抑制PERK-eIF2α和ATF6這兩條ERS信號通路的激活來降低CHOP的表達，從而減少TM所致的HUVECs凋亡。

綜上所述，本研究顯示喬松素可減輕ERS所介導的HUVECs凋亡，其機制可能與抑制PERK-eIF2α和ATF6信號通路，進而下調CHOP表達有關。但鑒于本工作是以HUVECs為研究對象的體外細胞水平實驗，與臨床人體疾病的復雜性有著很大的區別，因此有關喬松素等黃酮類化合物抗AS的臨床研究還有待進一步開展。