CD36/Src/ERK通路參與單核細胞向巨噬細胞的分化*

夏 珺， 俞 婷， 趙 蕾

（重慶醫科大學脂糖代謝性疾病重慶市重點實驗室，脂質研究中心，重慶400016）

隨著生活水平的提高，動脈粥樣硬化已經成為世界范圍內血管性死亡的主要原因[1]。在動脈粥樣硬化的發病過程中，循環中的單核細胞黏附于血管壁內皮細胞，分化成為巨噬細胞，進而進入內膜、吞噬脂質，形成泡沫細胞，因此單核細胞向巨噬細胞的分化是動脈粥樣硬化病變早期的典型事件。有研究提示通過抑制單核細胞向巨噬細胞的分化可以抑制動脈粥樣硬化的發展[2]，但具體機制還有待進一步研究。

CD36又稱脂肪酸轉位酶（fatty acid translocase，FAT），是一種廣泛分布于單核細胞、巨噬細胞和脂肪細胞上的膜糖蛋白，屬于B類清道夫受體家族。有研究報道，CD36在單核細胞向巨噬細胞的分化過程中表達增加[3]。但是CD36的表達是否會影響巨噬細胞的分化還尚未見相關報道。因此，本研究擬用人源單核巨噬細胞THP-1為研究對象，通過干擾和過表達CD36，探討CD36對單核細胞向巨噬細胞分化過程的影響及其分子機制。

材料和方法

1 細胞株

人源單核細胞THP-1購于美國模式培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

2 主要試劑

胎牛血清購于UTR；RPMI-1640培養基購于Hy-Clone；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購于Sigma；Trizol RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒及SYBR real-time PCR試劑盒購于TaKaRa；BCA蛋白檢測試劑盒、β-actin兔抗人多克隆抗體和結晶紫購于北京鼎國公司；FAT/CD36兔抗人多克隆抗體購于Novus；CD36-PE抗體購自BD；細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p-ERK、p-Src和Src兔抗人多克隆抗體購于CST；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或鼠IgGⅡ抗購于北京中杉金橋公司；PVDF膜購于Millipore；ECL化學發光試劑購于Bio-Rad；引物由北京華大基因公司合成；CD36過表達慢病毒購于上海吉凱基因化學有限公司。

3 主要方法

3.1 細胞培養及傳代 使用含10%（體積分數）胎牛血清、1×105U/L青霉素G和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640完全培養基，將細胞置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養。每天將細胞吹散，每2 d換液1次，3～4 d傳代1次。

3.2 細胞誘導 給予0、100和200 μg/L PMA誘導THP-1細胞，使之分化為貼壁生長的巨噬細胞。

3.3 干擾細胞的CD36表達CD36小干擾RNA（CD36small interfering RNA，siCD36）由上海生工生物工程公司設計并合成，正義鏈為5’-GGCUGUGUUUGGAGGUAUUCUTT-3’，反義鏈為 3’-TTCCGACACAAACCUCCAUAAGA-5’；陰性對照 scrambled siRNA（scrRNA）也由該公司提供。將THP-1細胞接種于6孔板，用scrRNA及siCD36分別轉染THP-1細胞：在50 μL RPMI-1640培養基中加入0.25 μL siRNA，短暫輕柔渦旋，加入1 μL RNAiMAX，短暫輕柔渦旋，室溫孵育15 min（15～25 ℃），將轉染復合物逐滴加入到THP-1細胞中12 h，進行后續實驗。

3.4 構建CD36過表達細胞系 采用CD36 cDNA的重組慢病毒轉染構建CD36過表達（CD36OE）細胞系，或以空載體（vector）作為對照，然后用嘌呤霉素篩選轉染的細胞，進行后續實驗。

3.5 Western blot實驗 取對數生長期的THP-1細胞接種于6 cm皿中常規誘導24和48 h后收集細胞，PBS洗滌細胞3次，加RIPA（含蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑），4℃裂解30 min。4℃、12 000×g離心15 min，吸取上清液，BCA法進行蛋白定量。經8%SDS-PAGE分離蛋白，PVDF膜轉膜，3%BSA室溫封閉1 h后，加入抗CD36抗體（1∶1 000）、抗p-ERK抗體（1∶1 000）、抗ERK抗體（1∶1 000）、抗p-Src抗體（1∶1 000）、抗Src抗體（1∶1 000）和抗β-actin抗體（1∶3 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，加Ⅱ抗于37℃搖床中孵育1 h，TBST清洗2次，每次15 min，最后用TBS洗滌1次，化學發光劑ECL顯色曝光，采用ImageJ軟件進行分析。

3.6 real-time PCR檢測mRNA水平 使用Trizol提取細胞總RNA并檢測其含量和純度。將1 μg總RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件為：37℃5 min，85℃5 s，4℃5 min后終止。反應產物保存于-20℃。取2 μL逆轉錄產物進行real-time PCR，以β-actin為內參照，反應體系為25 μL。擴增條件為：94℃1 min；94℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 10 s，39個循環。記錄Ct值，以2-ΔΔCt計算目的基因轉錄水平。引物序列見表1。

表1 real-time PCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

3.7 細胞黏附實驗 結晶紫染色觀察細胞黏附情況。將細胞種于96孔板中，PBS洗2次，附著的細胞固定在4%的多聚甲醛中5 min。0.5%的結晶紫在20%的甲醇中溶解，配制成結晶紫染色液，染色3 min。將細胞在空氣中干燥，用10%乙酸洗脫，595 nm下分光光度計檢測吸光度（A）值。

3.8 細胞形態觀察 取對數生長期的THP-1細胞接種于6 cm皿中常規誘導24 h，在普通光學顯微鏡下拍攝其形態，用ImageJ處理圖像，求每個細胞的相對表面積（總的細胞相對表面積/細胞數）。

3.9 流式細胞術 取對數生長期的THP-1細胞接種于6 cm皿中，給予100 μg/L PMA誘導分化0 h、24 h、48 h和72 h。PBS洗滌細胞3次，收集細胞。對照管不加抗體，向待測管中加入抗人CD36-PE抗體，常溫下孵育15 min。加入1 mL PBS，流式細胞儀檢測細胞表面的CD36表達。

4 統計學處理

所有數據均采用GraphPad Prism 5統計分析軟件進行處理，所得到的數值均以均數±標準誤（mean±SEM）表示，兩組之間的差異采用t檢驗差異分析，用單因素方差分析通過Tukey的多重比較檢驗對3組之間的差異進行統計分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 人單核細胞THP-1向巨噬細胞分化過程中CD36表達增加

給予不同濃度的PMA處理THP-1細胞，誘導THP-1細胞向巨噬細胞分化。巨噬細胞分化過程中，細胞黏附性增加（P＜0.01），見圖1A。采用PMA（100 μg/L）處理THP-1細胞不同時間，分別用流式細胞術、Western blot和real-time PCR檢測THP-1細胞內CD36的蛋白和mRNA水平，結果顯示，在分化過程中CD36表達增加（P＜0.01），見圖1B～D。

2 干擾CD36抑制人單核巨噬細胞THP-1向巨噬細胞的分化

構建敲減CD36基因（CD36i組）和陰性對照（NCi組）THP-1細胞，利用real-time PCR和Western blot檢測CD36的mRNA和蛋白表達情況。結果顯示，與NCi組比較，CD36i組CD36的mRNA和蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖 2A、B。這表明敲減CD36基因的THP-1細胞模型建立成功。

在光學顯微鏡下觀察兩組THP-1細胞分化過程中的形態變化。結果顯示，與NCi組比較，CD36i組細胞表面積明顯減?。≒＜0.01），見圖2C；結晶紫染色法檢測兩組THP-1細胞分化過程中黏附活性差異顯示，CD36i組的THP-1單核細胞黏附活性明顯小于陰性對照組（P＜0.01），見圖2D；real-time PCR檢測兩種THP-1細胞分化過程中CD11b和CD80的mRNA表達，結果表明CD36i組的THP-1單核細胞CD11b和CD80的mRNA明顯低于陰性對照組（P＜0.01），見圖2E、F。

3 過表達CD36促進人單核巨噬細胞THP-1向巨噬細胞分化

構建CD36OE THP-1細胞系，同時采用vector轉染細胞作為對照，利用real-time PCR和Western blot檢測CD36的mRNA和蛋白表達情況。結果顯示，與vector組比較，CD36OE組CD36的mRNA和蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見圖3A、B。這表明CD36過表達THP-1細胞系建立成功。

Figure 1.CD36 expression in the process of monocyte-macrophage differentiation.A：THP-1 cells were incubated with PMA（0，100 and 200 μg/L）for 24 h，and the crystal violet absorbance（A）was measured at a wavelength of 595 nm；B：the protein expression of CD36 was analyzed by flow cytometry；C：the mRNA level of CD36 was detected by real-time PCR；D：the protein expression of CD36 was determined by Western blot.Mean±SEM.n=3.##P＜0.01 vs 0 μg/L group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h group.圖1 CD36在單核巨噬細胞向巨噬細胞分化過程中的表達變化

在光學顯微鏡下觀察兩種THP-1細胞分化過程中的形態變化。結果顯示，與vector組比較，CD36OE組細胞表面積明顯增大（P＜0.05），見圖3C；結晶紫染色法檢測兩種THP-1細胞分化過程中黏附活性差異，CD36過表達組的THP-1單核細胞黏附活性明顯大于對照組（P＜0.01），見圖3D；real-time PCR檢測兩種THP-1細胞分化過程中CD11b和CD80的mRNA，結果顯示，CD36過表達組的THP-1單核細胞CD11b和CD80的mRNA水平明顯高于對照組（P＜0.01），見圖3E、F。

4 干擾CD36表達抑制ERK的磷酸化

THP-1細胞向巨噬細胞分化過程中，Western blot檢測ERK及其磷酸化水平，結果表明，隨著分化時間延長，ERK的磷酸化水平明顯升高（P＜0.05），見圖4A。NCi組和CD36i組的THP-1細胞向巨噬細胞分化過程中，Western blot檢測p-ERK和ERK的蛋白水平變化，結果表明干擾CD36表達后，ERK的磷酸化水平明顯低于對照組（P＜0.05），見圖4B。

5 干擾CD36表達抑制Src信號通路

NCi組和CD36i組的THP-1細胞向巨噬細胞分化過程中，采用Western blot檢測Src酪氨酸激酶及其磷酸化水平。結果表明，干擾CD36后，Src的磷酸化水平明顯低于對照組（P＜0.05），見圖5。

討 論

Figure 2.The effect of CD36 expression knock-down on the differentiation of THP-1 cells into macrophages.THP-1 cells were incubated with PMA（100 μg/L）for 24 h.A：the mRNA expression of CD36 in the THP-1 cells was detected by real-time PCR；B：the protein expression of CD36 in the THP-1 cells was determined by Western blot；C：the optical microscopic images（×400）showed the monocyte adhesion，and the surface area was determined；D：the crystal violet absorbance（A）was measured at a wavelength of 595 nm；E：the mRNA expression of CD11b in the THP-1 cells was detected by real-time PCR；F：the mRNA expression of CD80 in the THP-1 cells was detected by real-time PCR.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCi group.圖2 敲減CD36表達對THP-1細胞向巨噬細胞分化的影響

既往研究認為，單核細胞向巨噬細胞的分化在動脈粥樣硬化的發展中起著重要的作用。循環單核細胞在暴露于各種調節信號后會分化為組織巨噬細胞，并繼續積累，形成具有黏附性的動脈病變斑塊。眾所周知，單核細胞向巨噬細胞的分化可以促進炎癥和動脈粥樣硬化[4]。因此，調節單核細胞向巨噬細胞的分化可以為炎癥性疾病如動脈粥樣硬化提供至關重要的保護。

CD36作為B類清道夫受體，可識別較多致炎的內源性代謝產物，如氧化低密度脂蛋白、長鏈脂肪酸、非修飾的脂蛋白和淀粉樣蛋白等[5]，已被認為是將機體的天然免疫和代謝過程有機聯合在一起的重要靶點。既往研究提示，CD36調控巨噬細胞遷移、炎癥和介導氧化低密度脂蛋白的攝取，導致泡沫細胞形成，在動脈粥樣硬化發生發展中起關鍵作用[6-7]。人主動脈粥樣斑塊中巨噬細胞上CD36的表達顯著增加[8]。CD36的異常升高可能是動脈粥樣硬化病變發生和發展的生物標志事件之一。但目前CD36在動脈粥樣硬化中的功能是有爭議的，CD36表達可能存在“最佳保護窗口”[1]。

本研究發現，在THP-1細胞向巨噬細胞的分化過程中，CD36的表達是升高的，與既往的研究結果一致[3]。單核細胞向巨噬細胞分化的一個重要標志是細胞表面積增大，有偽足樣突起，黏附性增加[9]。分化標記物CD11b，CD80的表達也增加[10-11]。我們發現干擾CD36后THP-1細胞向巨噬細胞的分化減少，表現為細胞表面積和偽足樣突起減少，粘附能力下降；CD11b和CD80的表達降低；同時在CD36過表達的THP-1細胞上，THP-1細胞向巨噬細胞的分化增加，表現為細胞表面積和偽足樣突起增加，黏附能力增強；CD11b和CD80的表達升高。

ERK1和ERK2是涉及許多細胞途徑的絲氨酸/蘇氨酸激酶。既往研究表明ERK1/2途徑參與細胞生長和分化，ERK1/2完全缺失的骨髓前體細胞，由于M-CSF無法通過ERK傳遞關鍵的生長信號而無法有效生長或分化為巨噬細胞[12]。單核巨噬細胞中ERK1/2的激活，可通過影響單核細胞分化而導致心血管炎癥性疾病，參與動脈粥樣硬化的形成[13]。我們發現單核細胞分化過程中ERK的磷酸化水平是升高的，與既往的研究一致[9]。干擾CD36抑制了單核細胞分化過程中磷酸化ERK1/2的上調，并且減少了其向巨噬細胞的分化，說明CD36可能通過ERK通路調節單核細胞向巨噬細胞的分化。

Figure 3.The effect of CD36 over-expression on the differentiation of THP-1 cells into macrophages.THP-1 cells were incubated with PMA（100 μg/L）for 24 h.A：the mRNA expression of CD36 in the THP-1 cells was detected by real-time PCR；B：the protein expression of CD36 in THP-1 cells was determined by Western blot；C：the optical microscopic images（×400）showed the monocyte adhesion，and the surface area was determined；D：the crystal violet absorbance（A）was measured at a wavelength of 595 nm；E：the mRNA expression of CD11b in the THP-1 cells was detected by real-time PCR；F：the mRNA expression of CD80 in the THP-1 cells was detected by real-time PCR.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group.圖3 CD36過表達對THP-1細胞向巨噬細胞分化的影響

Figure 4.The effect of CD36 expression knock-down on ERK phosphorylation.A：THP-1 cells were incubated with PMA at 100 μg/L for 0，24 and 48 h，and the protein levels of p-ERK and ERK were determined by Western blot；B：THP-1 cells were incubated with PMA（100 μg/L）for 24 h，and the protein levels of p-ERK and ERK in the THP-1 cells was determined by Western blot.Mean±SEM.n=3.##P＜0.01 vs 0 h group；*P＜0.05 vs NCi group.圖4 敲減CD36表達對ERK磷酸化的影響

Figure 5.The effect of CD36 expression knock-down on Src phosphorylation.THP-1 cells were incubated with PMA at 100 μg/L for 24 h after knock-down of CD36，and the protein levels of p-Src and Src in the THP-1 cells were determined by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs NCi group.圖5 敲減CD36對Src磷酸化的影響

在許多情況下，CD36介導的細胞內信號轉導是由Src家族非受體酪氨酸激酶引發的。Src家族激酶不僅在腫瘤生物學中發揮重要作用，而且還調節巨噬細胞功能，包括在泡沫細胞形成和促炎性細胞因子表達中發揮作用[14]。Src家族的磷酸化和活化，可進一步激活絲裂原激活的蛋白激酶ERK1/2[15]。在本研究中，我們也發現干擾CD36表達，抑制THP-1細胞分化過程中磷酸化Src的上調，提示抑制CD36表達顯著抑制Src通路的活性。

綜上所述，CD36可以激活Src的磷酸化，進一步促進ERK的磷酸化和活化，最終促進單核細胞向巨噬細胞的分化。本研究為臨床治療及預防動脈粥樣硬化提供了新的思路。