氧化三甲胺通過促進成年小鼠心肌細胞T小管重構加重心力衰竭

靳 步，紀方方，左安俊，劉薈婷，祁 琳，何 韻，王慶堯，趙 鵬△

（1青島大學附屬醫院病理科，山東青島266000；2青島大學醫學部基礎醫學院，山東青島266071；3山東省青島療養院，山東青島266071；4青島大學附屬醫院普外科，山東青島266000）

心力衰竭（heart failure，HF；簡稱心衰）是導致心血管疾病患者死亡的主要原因，絕大部分的心血管疾病最終都會導致心衰[1-2]，因此心衰病理機制的研究對發現新的臨床診療方法具有重要意義。

近年來的研究發現，腸道微生物群參與了許多疾病的發病過程，如肥胖、糖尿病、胃腸疾病、癌癥、心血管疾?。òㄐ乃ィ┑萚3-4]。目前的心衰腸道假說認為，心衰可導致細菌移位，增加全身循環中細菌的產生，增加炎癥狀態，從而導致心衰的進一步發展。氧化三甲胺（trimethylamineN-oxide，TMAO）是由腸道微生物群的代謝產物，腸道微生物群組成的改變會導致TMAO水平升高，產生循環內毒素，進而發展為心衰[5-7]。動物實驗表明，在心衰小鼠的心肌細胞中，微管蛋白（tubulin）上調、T小管重構是一個重要和常見的現象[8]。微管是由α-和β-微管蛋白二聚體聚合而成的普遍存在的細胞骨架纖維，而TMAO能夠促進微管蛋白聚合[9]，微管聚合可導致連接蛋白家族成員的親聯蛋白2（junctophilin-2，JPH2）再分布，從而導致心臟T小管與肌質網的錯位，造成心肌收縮功能減退[10]。在一項有1 020名受試者的研究中，通過心臟導管檢查發現在進行了冠狀動脈疾病血管造影的患者中，TMAO循環水平顯著升高[11]。此外，在另外一組正在進行心導管檢查的受試者中（n=4 007），TMAO水平升高獨立地預測了不良心血管結局的風險，如心臟病發作、中風和死亡風險[7]。在心衰患者中，TMAO血漿水平升高（n=720），升高的TMAO水平與5年死亡風險增加有關[4]。

目前，腸道微生物群失調在心衰發生發展中的作用有待進一步研究，我們推測TMAO的升高可能導致T小管重構和Ca2+處理紊亂，從而損害心臟收縮功能。本研究探討TMAO對成年小鼠心室肌細胞微管蛋白和T小管結構的影響，為腸道菌群紊亂在心功能下降及心力衰竭中的作用機制提供參考資料。

材料和方法

1 成年小鼠心室肌細胞分離培養

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，2～3月齡，體重25～35 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（魯）2019-0003。小鼠腹腔內注射戊巴比妥鈉（100 mg/kg），使用Langendorff法心臟灌流[0.5 g/L的2型膠原酶（Worthington）和0.08 g/L的XVI型蛋白酶（Sigma-Aldrich）]12 min到15 min；實驗采用≥75%Ca2+耐受桿狀肌細胞。在含1.0 mmol/L Ca2+的臺氏液[其組成（mmol/L）：137 NaCl，5.4 KCl，10葡萄糖，10 HEPES，0.33 NaH2PO4，1 Mg-Cl2；用氫氧化鈉將pH值調整至7.35～7.45]中處理10 min，細胞在含有基本培養液（MEM）與10%胎牛血清的經層粘連蛋白（10 mg/L）預處理的T25瓶中培養[12]。將細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養 2 h，后將培養液改為不含血清的MEM，培養24 h。

2 細胞處理

細胞經不含血清的MEM培養24 h后，再將細胞分別置于含有0.3、1、3和 10 μmol/L TMAO（Sigma-Aldrich）的條件下培養24 h，分析TMAO對心肌細胞T小管的影響，并選擇一個合適的濃度進行后續實驗。

3 方法

3.1 T小管成像與分析 采用Di-8-ANEPPS（10 μmol/L；AAT BioQuest）在無鈣臺氏液中室溫染色30 min。用LSM 510型共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss MicroImaging Inc.）的63倍透鏡觀察T小管結構。采用IDL圖像分析程序對T小管完整性進行定量分析，使用AutoTT軟件分析T小管功率（T-tubule power，TTpower）的強弱來反映T小管組織的規整性[9]。

3.2 Western blot 心肌細胞用冷PBS沖洗3次，懸浮于裂解液[其組成（mmol/L）：50 Tris-HCl（pH 7.4），150 NaCl，10 NaF，1釩酸鈉，5 EGTA，5 EDTA；還有0.2%Triton X-100，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS]中。將裂解液13 000×g、4℃離心15 min，上清液作為全細胞蛋白保存。采用BCA法（Pierce）測定蛋白濃度。全細胞蛋白樣品在10%的雙三聚體凝膠上電泳。電泳后將蛋白轉移至PVDF膜（Millipore），并在 4℃條件下使用 JPH2（1∶1 000；Santa Cruz）、calpain I（1∶5 000；Cell Signaling Technology）和 GAPDH（1∶5 000；Sigma-Aldrich）的 I抗過夜。PBS洗滌3次后，用辣根過氧化物酶偶聯的II抗（在PBS溶液中1∶50 000～1∶10 000稀釋）繼續孵育。免疫反應采用增強化學發光檢測試劑盒（Pierce）和LAS-3000科學成像系統（FujiFilm）進行可視化。使用NIH ImageJ 1.43d軟件對條帶進行量化。

3.3 游離和聚合微管蛋白的測定 使用微管/微管蛋白體內檢測試劑盒（Cytoskeleton Inc.）檢測游離和聚合的微管蛋白。在細胞裂解和微管穩定緩沖液（含 5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、0.1 mmol/L GTP、1 mmol/L ATP、100 mmol/L PIPES、30% 甘油、0.1%壬酸酯-p40、0.1%Triton X-100、0.1%吐溫-20、0.1%β-巰基乙醇、0.001%抗泡劑和0.2%蛋白酶抑制劑，pH 7.4）中均質化細胞。勻漿通過離心機（37℃、100 000×g離心30 min）產生浮層包含自有的微管蛋白和聚合顆粒微觀沉淀，用200 μmol/L氯化鈣對聚合微管顆粒進行重懸。

3.4 心肌細胞免疫熒光染色 分離的心肌細胞在4%多聚甲醛中37℃固定15 min，用PBS沖洗3次，每次10 min，然后在含有0.3%Triton-X 100的PBS中滲透30 min。在室溫下1%BSA封閉30 min后，β-tubulin抗體（1∶100；Sigma）和JPH2抗體（1∶50；Santa Cruz）4℃條件下孵育過夜。I抗孵育過后，與熒光標記的II抗在室溫下孵育2 h。用63倍透鏡共聚焦顯微鏡觀察。用ImageJ 1.43d軟件定量微管密度，用IDL圖像分析程序分析JPH2結構（JPH2 power）。

3.5 共聚焦Ca2+成像 將心肌細胞置于含有5 μmol/L Fluo-4 AM（Invitrogen）和1.8 mmol/L Ca2+的臺氏液中預處理30 min，然后用無染料的臺氏液洗滌細胞20 min，使其脫酯化，然后成像處理。采用共聚焦顯微鏡沿肌細胞縱軸進行掃描，獲取Ca2+圖像。1 Hz磁場刺激下，在含有1.8 mmol/L Ca2+的臺氏液中測量穩態Ca2+瞬態，停止磁場刺激后5 s左右記錄Ca2+火花。8個像素中每個掃描像素的觸發時間的平均絕對偏差為Ca2+瞬變失同步化指數，用來評估Ca2+瞬態的失同步性[13]。

3.6 小鼠心功能檢測 將10只雄性SPF級C57BL/6小鼠分為TMAO組與對照組，每組各5只。將0.12%TMAO添加到TMAO組小鼠飼料中，6周后與喂養正常鼠糧的對照組小鼠一同進行心功能檢測。

4 統計學處理

數據用均數±標準差（mean±SD）表示。多組比較采用單因素方差分析；兩組比較采用t檢驗。采用SPSS 15.0軟件進行統計分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TMAO導致心肌細胞T小管網絡損傷

在檢測濃度（0.3～10 μmol/L）范圍內，TMAO對心肌細胞T小管組織的損傷呈濃度依賴性，3 μmol/L和10 μmol/L的TMAO更顯著地降低了T小管密度和TTpower（P＜0.01），見圖1?；谝陨辖Y果，我們選擇3 μmol/L的TMAO用于后續實驗。

2 TMAO導致鈣離子處理功能障礙

心肌細胞經TMAO（3 μmol/L）培養24 h后，Ca2+瞬變平均振幅顯著降低，到達Ca2+瞬變峰值的時間顯著延長，失同步化指數顯著增大（P＜0.01），見圖2。此外，TMAO處理導致自發Ca2+火花頻率和Ca2+火花振幅顯著增加（P＜0.01），但Ca2+火花平均時間半高寬和Ca2+火花半峰全寬無明顯改變，見圖3。

3 TMAO誘導心肌細胞JPH2從T小管向外周質膜再分布

與對照組相比，TMAO作用24 h后心肌細胞的JPH2分布發生改變。主導頻率下JPH2功率的峰值是反映JPH2規律性的定量指標。計算結果顯示，TMAO組JPH2功率降低（P＜0.01），見圖4A、B。此外，經TMAO處理的心肌細胞在心肌細胞邊緣可見明顯的JPH2堆積（P＜0.01），見圖4A、C。與對照組相比，TMAO組心肌細胞JPH2蛋白表達水平無明顯變化（P＞0.05），見圖4D、E。

4 TMAO促進心肌細胞微管的聚合

與對照組相比，經TMAO處理后的心肌細胞微管網絡密度顯著升高（P＜0.01），見圖5A。Western blot結果顯示，經TMAO處理后的小鼠心肌細胞微管聚集性顯著增強（P＜0.01），見圖5B。

5 TAMO損害小鼠心功能

超聲心動圖顯示，TMAO組小鼠心臟收縮功能（左心室射血分數）較正常喂養的對照組小鼠顯著下降（P＜0.05），見圖6。

討 論

心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD），包括動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭、房顫、心肌纖維化等，與世界范圍內的高死亡率相關。吸煙、不良的飲食習慣、肥胖、糖尿病、高膽固醇等是眾所周知的危險因素[1]。近年來的研究表明，腸道微生物群及其代謝產物在CVD的發生發展中起著關鍵作用[14]。動物模型證實了膽堿、腸道微生物群和TMAO加速了動脈粥樣硬化、心力衰竭等CVD的發展，并與疾病嚴重程度有關。在動物實驗中，經TMAO灌胃后的小鼠，心臟體積明顯增大[15]。臨床數據也表明，心力衰竭患者血漿中腸道微生物源代謝物TMAO濃度呈現升高趨勢[4]。心肌興奮-收縮偶聯功能的關鍵是T小管和肌質網之間的空間關系，在心臟動作電位過程中，Ca2+通過L型Ca2+通道激活鄰近肌質網膜上的雷諾丁受體（ryanodine receptors，RyRs），從肌質網釋放更多的Ca2+[16]。T小管存在于正常成年哺乳動物的心肌細胞中，與細胞外空間連續，并深入到哺乳動物心室肌細胞的內部[17]。在各種心臟疾病，包括不同類型的心力衰竭和心肌病等情況下，T小管會發生顯著的重塑或丟失。

Figure 1.Effects of TMAO on T-tubule structure in adult mouse cardiomyocytes（Di-8-ANNEPS staining，×63）.Isolated adult mouse cardiomyocytes were exposed to increasing concentrations of TMAO for 24 h.The global T-tubule density and T-tubule power（TTpower）were determined.Mean±SD.There were 25～30 cells in each group.*P＜0.05 vs control group.圖1 TMAO對成年小鼠心肌細胞T小管結構的影響

TMAO和心衰之間的機制是否與心肌細胞T小管重構有關，目前尚不清楚。因此，在我們的研究中，我們將分離的成年小鼠心肌細胞利用TMAO處理，來確定TMAO是否會破壞T小管結構以及T小管丟失或（和）紊亂的程度。結果顯示，暴露于TMAO條件下24 h的小鼠心肌細胞T小管結構紊亂，經TMAO處理后的小鼠心肌細胞T小管密度及TTpower顯著下降。由于Ca2+從肌質網釋放是由Ca2+通過細胞膜內流觸發的，而T小管重構破壞了位于T小管膜上的電壓門控L型Ca2+通道與肌質網上的Ca2+釋放通道（RyR2）之間的精確通信，從而干擾肌質網Ca2+釋放的快速電激發、啟動和同步觸發[18-19]。因此，我們研究了TMAO是否能誘導分離的心肌細胞Ca2+處理紊亂。結果顯示，經TMAO培養的小鼠心肌細胞到達Ca2+瞬變峰值的時間顯著延長，Ca2+瞬變同步化減少，自發Ca2+火花頻率和Ca2+火花振幅也明顯增加。這些數據表明，TMAO能夠破壞心肌細胞Ca2+處理和干擾Ca2+再利用。Ca2+釋放的同步化保證了心室內的細胞收縮是協調一致的，隨著心室壓力的增加和體積的減小，心肌的收縮會把血液擠出心臟。哺乳動物的心室肌細胞幾乎同步從肌質網觸發釋放Ca2+，引起心肌細胞去極化，而主要負責每個細胞內局部Ca2+釋放同步化的就是T小管系統。Ca2+非同步化釋放常以Ca2+觸發釋放的傳播延遲為特征，心肌細胞到達Ca2+瞬變峰值的時間延長，導致細胞收縮和（或）Ca2+瞬變功能障礙。

Figure 2.TMAO impaired Ca2+handling in the cardiomyocytes.Mean±SD.There were 25～30 cells in each group.**P＜0.01 vs control group.圖2 TMAO抑制心肌細胞Ca2+處理

Figure 3.Cardiomyocytes treated with TMAO displayed more Ca2+sparks（Fluo-4 AM staining，×63）.FDHM：full duration at half maximum；FWHM：full width at half maximum.Mean±SD.There were 15～30 cells in each group.**P＜0.01 vs DMSO group.圖3 經TMAO處理的心肌細胞產生更多的Ca2+火花

T小管重構是在不同病因的晚期心力衰竭中一個重要和常見的現象，T小管重構導致的Ca2+釋放不同步使心肌收縮力降低[8]。隨著T小管完整性的喪失，收縮期Ca2+瞬時變化的“鈣觸發鈣釋放”模式發生干擾。T小管斷裂，L型Ca2+通道與RyR2發生錯位，導致“孤立的”RyR簇，從而增加了Ca2+火花誘導Ca2+火花發生的機會[20-21]。Na+-Ca2+交換器的缺失以及因此而導致的更廣泛的Ca2+細胞分布可能使大型哺乳動物的心室或心房易于發生Ca2+依賴的延遲去極化，這可能是大型哺乳動物心室肌細胞Ca2+超載機制的基礎[22-23]。局部的Ca2+超載可能導致異常Ca2+釋放，這可能是導致心肌收縮功能障礙的原因。

Figure 4.TMAO aggravated JPH2 translocation in the cardiomyocytes.A：representative images of isolated cardiomyocytes stained with anti-JPH2 antibody after treatment with or without TMAO for 24 h（×63）；B：JPH2 power；C：semi-quantitative analysis of JPH2 distribution between T-tubule and peripheral sarcolemma；D：representative image of Western blot；E：densitometric data of Western blot.Mean±SD.There were 15～30 cells in each group.**P＜0.01 vs DMSO group.圖4 TMAO加重了心肌細胞中JPH2的易位

Figure 5.More rearrangement and densification of microtubules in the cardiomyocytes with TMAO treatment.A：β-tubulin immunofluorescence staining in cells treated with or without TMAO（×63）；B ：Western blot of free（F）and polymerized（P）β-tubulin.Mean±SD.There were 20～25 cells in each group.**P＜0.01 vs DMSO group.圖5 在TMAO處理下，心肌細胞的微管發生更多重排和致密化

Figure 6.TMAO undermined mouse cardiac function.A：the protocol showed how to treat mice with TMAO and assay the left ventricular ejection fraction（LVEF）；B：representative short-axis echocardiographic images of left ventricle M-mode recordings from chow-and TMAO-treated mice；C：quantitative evaluation of LVEF.Mean±SD.n=4～5.*P＜0.05 vs chow group.圖6 TMAO破壞小鼠心臟功能

維持T小管組織的關鍵是JPH2，它將T小管連接在肌質網上，保障心臟二聯體的結構[24]。JPH2在興奮細胞中連接細胞膜和肌質網的物理間隙，維持正常心室肌細胞的連接膜復合體[25]。JPH2基因敲除對胚胎是致命的；而敲減JPH2基因的胚胎，其肌細胞存在缺陷的心臟二聯體，包括更多沒有JPH2的肌質網片段[26]。研究還表明，JPH2在心力衰竭動物模型中呈現重新分布和減少[16]。因此，我們推測JPH2易位和（或）下調可能在TMAO處理下引起的T小管重構中發揮重要作用。我們的結果表明，TMAO作用小鼠心肌細胞24 h后，JPH2分布發生改變，在心肌細胞邊緣可見明顯的JPH2堆積，提示TMAO處理后JPH2蛋白分布發生易位；此外，TMAO組的JPH2功率也降低。以上結果提示了JPH2蛋白易位可能是TMAO誘導的T小管紊亂的主要潛在機制。

由于微管表達的增加和穩定微管的形成，微管在代償期和失代償期積累并致密化。通過JPH2的再分布，微管致密化可導致心臟疾病和心肌細胞T小管重構。在一些研究中，TAMO的增加已成為預測心力衰竭嚴重程度的重要指標之一。數據表明，TMAO確實促進了微管蛋白聚合，并穩定了微管，使微管不受失穩擾動[9]。因此，我們研究了TMAO是否參與導致微管積聚和興奮-收縮偶聯功能障礙，結果顯示，小鼠心肌細胞經TMAO處理后，與對照組相比，微管網絡的致密化和聚集性顯著增強。先前的研究表明，微管蛋白致密化介導了JPH2在心臟應激反應中的易位現象[16]，這與我們的研究結果一致，即由于微管蛋白聚合增加，JPH2在TMAO處理中發生錯位。JPH2在維持成年心臟心肌細胞T小管結構完整性和維持 Ca2+處理方面是必需的[10，21]。我們的實驗結果顯示，TMAO誘導的JPH2易位促進了T小管重塑，并且動物實驗的結果也表明TMAO能夠使小鼠心功能下降。

總之，本研究為TMAO如何通過促進小管蛋白的形成和隨后JPH2的易位而損害心功能提供了證據。這些實驗結果表明，減少TMAO的產生，如改善腸道菌群的質量或防止腸道菌群失調，可能在一定程度上能夠保護心功能和延緩心衰的發展。