解郁丸對WKY抑郁樣大鼠前額葉皮層與海馬樹突棘的影響*

劉紅梅，李 琦，宋 苗，張 宇，徐 勇△

（山西醫科大學 1基礎醫學院，2第一醫院精神衛生科，山西太原030001）

抑郁癥具有高患病率、高致殘率、高自殺率及高復發率的特點，嚴重影響了人類的身心健康[1]。目前，抑郁癥的治療手段甚多，但都沒有得到滿意的療效。復方中藥解郁丸（Jieyuwan，JYW）由十多種成分組成，副作用較少，研究表明此藥可以影響海馬與前額葉皮層中腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達量，其抗抑郁機制與突觸可塑性存在密切關系[2]。樹突棘是中樞神經系統興奮性突觸傳遞的原始位點[3]，是接受信息、形成突觸聯系的重要部位，被認為是腦功能可塑性的基礎。樹突棘在數量和形態上都具有易變性，所以常導致突觸結構和功能發生病理性的改變而引發各類疾病的發生，但在抑郁癥中樹突棘結構改變的相關報道尚少。

突觸后致密區蛋白95（postsynaptic density protein-95，PSD-95）是突觸后膜致密區的一種支架蛋白，存在于興奮性谷氨酸能突觸內[4]，在樹突棘中位于其頭部，參與興奮性突觸傳遞的功能調控[5]。在抑郁癥中PSD-95蛋白的表達水平與樹突棘的病理變化是否一致，目前報道很少。

由此，本研究選用Wistar-koyoto（WKY）抑郁模型大鼠研究前額葉皮質與海馬組織中樹突棘的病理變化及PSD-95蛋白的表達情況，并觀察中藥解郁丸的影響。

材料和方法

1 實驗動物

以45只成年雄性WKY大鼠（體重約250～280 g）為研究對象，選取同品系SPF級Wistar大鼠15只作為空白對照（Wistar）組，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號為SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養于山西醫科大學SPF級動物中心，每個籠子3只，設施維持在12 h亮/暗循環、溫度（22±2）℃、濕度50%～60%的環境中，實驗期間除行為學測試外動物可以自由獲得食物和水。

2 方法

2.1 動物分組與藥物處理 動物適應性喂養1周后，將Wistar大鼠（Wistar組）與WKY大鼠（WKY組）進行行為學實驗，以作為基線；然后將45只WKY大鼠隨機分為模型（WKY+NaCl）組、解郁丸（WKY+JYW）組和西酞普蘭（WKY+citalopram，WKY+CPM）組，每組15只，以15只Wistar大鼠為對照（Wistrar+NaCl）組。各組的給藥處理方式如下：（1）對照組：Wistar大鼠予以生理鹽水灌胃21 d；（2）模型組：WKY大鼠予以生理鹽水灌胃21 d；（3）解郁丸組：將解郁丸（212 mg/kg，河南泰豐制藥股份有限公司）根據文獻[6]用0.5%的羧甲基纖維素鈉制備混懸液，灌胃21 d；（4）西酞普蘭組：基于前人實驗[7]將氫溴酸西酞普蘭（10 mg/kg，丹麥靈北藥廠）溶于生理鹽水，灌胃21 d。

2.2 糖水偏好實驗 用糖水偏好實驗對抑郁大鼠快感缺失行為進行檢測。將大鼠均單獨飼養于一個籠子并自由飲食，實驗第1天適應雙瓶飲水，第2天換成含1%蔗糖的雙瓶飲用1天，第3天放置相等重量的雙瓶（一瓶為純水，一瓶為1%的蔗糖水）進行測試，測試時間為9：00～15：00，期間每3 h交換一次位置，防止產生位置偏愛，測試結束后稱量兩只水瓶剩余量，計算糖水偏好程度。糖水偏好系數（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%。

2.3 曠場實驗 用曠場實驗檢測抑郁大鼠在空曠空間的探索行為。大鼠被放置于裝有攝像機的自發活動箱（100 cm×100 cm×50 cm），設定中央區和外周區。將每只大鼠輕輕放在活動箱中央開始實驗，視頻記錄5 min。在每只大鼠測試之間，清理干凈活動箱并使用75%乙醇去除氣味。記錄大鼠在空曠空間活動的總距離以及在中央區的探索總時間。

2.4 強迫游泳實驗 用強迫游泳實驗檢測抑郁大鼠的絕望行為。強迫游泳實驗設備為直徑200 mm、高400 mm的裝有攝像機的透明玻璃箱。實驗水溫在23～25℃，水深在300 mm左右。實驗第1天為適應階段，將大鼠放入水中自由活動5 min，24 h后（第2天），用同樣的方法記錄自由活動5 min。每只大鼠游泳后都更換清水，游泳測試結束后將大鼠擦干，放回籠中。實驗記錄分析大鼠的漂浮不動時間。

2.5 高爾基染色 大鼠稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉（1%，50 mg/kg）進行深度麻醉，然后快速剝離出腦組織，并用三蒸水迅速沖洗腦組織表面的血液；再將腦組織切片，厚度不超過1 cm，放入浸漬液中浸泡（按照FD Rapid GolgiStain?Kit說明書進行操作）。取出浸泡好的腦組織，慢慢放入含有干冰的異戊烷快速冷凍組織；將冷凍好的組織固定在冰凍切片機上進行切片，切片厚度為100 μm。切片置于室溫黑暗處自然風干，然后進行染色，三蒸水洗片2次，每次4 min，再用工作液（FD Rapid GolgiStain? Kit提供）染片10 min，三蒸水洗2次。在50%、75%和95%乙醇中進行梯度脫水，每個梯度4 min。之后再在無水乙醇中脫水4次。在二甲苯中進行透明3次，之后用樹脂封片劑封片。在顯微鏡下拍照觀察。

2.6 Western blot實驗 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（1%，50 mg/kg）進行麻醉，快速取出腦組織于冰上分離前額葉皮層和海馬組織，速凍并轉移至-80℃保存。提取蛋白質，BCA法測蛋白濃度。配膠、電泳、轉膜、封閉，I抗（抗PSD-95抗體，1∶1 000；Abcam）4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入II抗（anti-mouse IgG，HRP-linked antibody，1∶2 000；Cell Signaling Technology）室溫孵育1 h。TBST洗膜，ECL進行曝光。

3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件對數據進行處理分析，數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示，組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 糖水偏好實驗結果

糖水偏好實驗結果顯示，給藥前，與Wistar大鼠相比，WKY大鼠糖水偏好程度明顯降低（P＜0.05），表明WKY大鼠表現出快感缺失的抑郁樣行為；經過21 d藥物干預后，WKY+JYW組和WKY+CPM組大鼠比給藥前的WKY大鼠糖水偏好程度明顯提高（P＜0.05），說明解郁丸使WKY大鼠的抑郁樣行為有所減少；藥物組之間無明顯差異，見圖1A。

2 強迫游泳實驗結果

與Wistar大鼠相比，WKY抑郁大鼠給藥前在強迫游泳實驗中的不動時間明顯增加（P＜0.05），即WKY大鼠表現出明顯的絕望抑郁樣行為；但給予藥物治療21 d后的WKY大鼠此情況明顯好轉，即WKY+JYW組和WKY+CPM組不動時間較給藥前的WKY大鼠顯著減少（P＜0.05），藥物組之間的差異無統計學顯著性，見圖1B。

3 曠場實驗結果

與對照組Wistar大鼠相比，WKY大鼠給藥前的總運動距離（P＜0.01）和在中心區的停留時間（P＜0.05）明顯降低，即WKY大鼠表現出對陌生空間的探索活動減少；但給予藥物治療21 d后的WKY大鼠此情況得到逆轉，即WKY+JYW組和WKY+CPM組總運動距離（P＜0.01）和中心探索時間（P＜0.05）顯著增加，藥物組之間的差異無統計學顯著性，見圖1C、D。

4 前額葉皮層與海馬組織高爾基染色結果

Golgi染色觀察顯示，與正常對照組Wistar大鼠相比，WKY大鼠前額葉皮層與海馬組織中的樹突棘明顯減少（P＜0.01），但在給藥治療后前額葉皮層和海馬組織中樹突棘密度顯著增多（P＜0.01），且藥物組之間的差異無統計學顯著性，見圖2。

5 Western blot實驗檢測前額葉皮層與海馬組織中PSD-95的表達水平

與對照組Wistar大鼠相比，WKY大鼠的前額葉皮層與海馬組織中PSD-95的蛋白表達量明顯降低（P＜0.01），經過21 d的藥物治療后，前額葉皮層與海馬中的PSD-95的表達水平增加（P＜0.01），而藥物組之間的差異無統計學顯著性，見圖3。

討 論

在研究抑郁癥的發病機制以及尋找新藥的作用靶點過程中，雖然以人類為研究對象更為直接，但是倫理的局限性讓我們不能更為深入地探討，因此在抑郁癥動物模型上的研究可能會大大提高我們對抑郁癥的發病機制及對新藥作用機制的理解。WKY大鼠是一種內源性抑郁樣大鼠模型，是通過其同品系Wistar大鼠雜交篩選獲得的大鼠，已經廣泛應用于抑郁癥的研究[8-10]。有研究發現該模型動物在強迫游泳實驗中的活動明顯減少，不動時間延長[9]。在本研究中，同樣發現WKY大鼠對糖水的偏好程度下降，表現出抑郁癥中的快感缺失，同時強迫游泳不動時間增加，展示出絕望的抑郁樣表現，并且曠場實驗中發現WKY大鼠活動距離減少，在中心探索的時間也下降，顯示出探索能力下降的抑郁樣表現，這些行為學結果與抑郁癥患者表現一致，經過中草藥解郁丸21 d的干預之后，發現WKY大鼠的上述抑郁樣行為有明顯逆轉，且與西酞普蘭組的差異無統計學顯著性，提示解郁丸對WKY抑郁模型大鼠長時間的治療可以同樣達到較好的效果。

Figure 1.The results of behavioral experiments.A：the results of sucrose preference test；B：immobility time in the forced swimming test；C：center time in the open-field test；D：total distance in the open-field test.Mean±SEM.n=15.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Wistar group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs WKY group.圖1 行為學實驗結果

樹突棘是興奮性突觸的主要突觸后結構基礎，它們通常接受來自軸突的興奮性輸入，構成大部分興奮性突觸的突觸后膜。在中樞神經系統中，大部分興奮性突觸位于樹突棘上，是神經元連接、信息存儲和處理大腦回路的、重要高度動態的結構[11-12]。有研究發現，重度抑郁癥患者的前額葉皮層中突觸蛋白表達減少，突觸數目減少[13]，且海馬存在樹突棘萎縮，樹突棘密度減少的病理狀態[14]。在慢性不可預測的輕度應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）大鼠模型上，發現海馬和內側前額葉皮層的主要神經元中樹突棘密度下降[15-16]。在本研究中，WKY大鼠模型中同樣發現海馬和前額葉皮層中樹突棘的密度降低，通過解郁丸或西酞普蘭治療后能夠提高WKY大鼠樹突棘密度值。因此，我們認為樹突棘具有高度的敏感性，可能是抑郁癥發生發展的重要結構之一，有可能成為研制新型抗抑郁藥物的重要靶結構。

PSD-95是突觸后致密區核心構架蛋白之一，位于中樞神經系統所有軸-樹突棘突觸的突觸后膜上，參與神經元生長、突起形成和突觸可塑性調節等[17]，是突觸后信號轉導和整合的結構基礎。有研究表明，創傷后應激障礙模型大鼠海馬CA1區PSD-95蛋白表達是減少的[18]；王雪銀等[19]發現，PSD-95表達的增加可以增強阿爾茲海默病大鼠的空間學習記憶能力。同樣在本研究中發現WKY抑郁大鼠的前額葉皮層與海馬組織中PSD-95的表達是降低的，經過藥物治療后明顯提高了PSD-95的表達水平，提示抑郁癥的發生以及抗抑郁藥物的作用機制與突觸可塑性均存在著聯系，可以應用PSD-95作為治療抑郁癥的觀察指標之一。

綜上所述，我們觀察到WKY抑郁樣模型大鼠具有快感缺失、絕望、認知下降等抑郁樣行為表現，并且海馬與前額葉皮層中樹突棘密度明顯下降，PSD-95蛋白的表達水平也降低，說明樹突棘的變化是抑郁癥導致的分子結構改變之一，抑郁癥的發生與突觸可塑性存在著聯系。以西藥西酞普蘭為陽性對照藥物，解郁丸可以減少WKY大鼠的抑郁樣行為，并提高海馬與前額葉皮層中的樹突棘密度及PSD-95蛋白的表達量，提示中藥解郁丸長時間應用效果與西藥的藥效相當，而且副作用少。本研究為解郁丸在臨床上的應用提供了更多的支持依據。

Figure 2.The results of Golgi staining.Dendritic spines in the prefrontal cortex（A）and hippocampus（B）were visualized by Golgi staining.The scale bar=10 μm.Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs Wistar group；##P＜0.01 vs WKY group.圖2 高爾基染色結果

Figure 3.The protein expression of PSD-95 in prefrontal cortex（A）and hippocampus（B）of rats was detected by Western blot.Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs Wistar group；##P＜0.01 vs WKY group.圖3 Western blot檢測PSD-95蛋白的表達水平