let-7a通過抑制MAP4K3/MKK4/JNK信號通路減少腦出血大鼠神經元調亡*

楊 慧，萬 廣，高絢照，柳 毅，王守春

（1新鄉市中心醫院神經內科，2新鄉醫學院第一附屬醫院骨科，河南新鄉453100；3吉林大學第一醫院，吉林長春130000）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是腦實質內血管破裂引起的出血，可導致原發性和繼發性損傷，是腦卒中最危險的亞型之一。在ICH發生發展過程中，神經元凋亡、星形膠質細胞增殖和少突膠質細胞死亡可引起離子穩態紊亂、水腫、出血、興奮性毒性、氧化應激和內質網應激等自毀性病理變化，最終導致殘疾，甚至死亡[1]。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）通過對靶基因的調控在細胞分化、增殖、凋亡等各種細胞過程中具有重要作用，其獨特的表達譜在調節血管疾病中具有重要作用[2]。在細胞中，miRNA控制程序性死亡（凋亡和自噬）；在大腦中，miRNA控制神經元分化和凋亡，如miR-125b、miR-132和miR-128參與調控神經元分化[3]；miR-365和miR-146a、miR-196b等參與神經元凋亡通路調控。在哺乳動物中，miRNA let-7a參與細胞的分化和凋亡，具有抗增殖作用[4]。在神經干細胞中，let-7a在分化過程中高表達[5]，失活可以阻止生長因子缺失的神經元細胞死亡。吳美華等[2]研究發現，在ICH引起的腦水腫中，let-7a下調了0.5倍。在此基礎上，本研究將研究let-7a對ICH后神經元凋亡的作用及分子機制，旨在為ICH治療尋找新的靶點和信號通路。

材料和方法

1 動物

48只健康Sprague-Dawley（SD）大鼠取自新鄉市中心醫院動物中心，許可證號為SYXK（川）2019-218，體重250～280 g。在溫度（25±1）℃、濕度60%的SPF環境下飼養，自由攝食、飲水，晝夜節律12 h。

2 主要試劑和儀器

2.1 實驗試劑 let-7a激動劑（agomir）、陰性對照（negative control，NC）agomir、let-7a拮 抗 劑（antagomir）、NC antagomir、let-7a模擬物（mimic）和 NC mimic由百奧邁科生物技術有限公司提供；Ⅶ型膠原酶、LipofectamineTM2000和PVDF膜購自Invitrogen；DMEM培養基（Yaji，PM150210）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA；PC0001）、20× TBS（T1080）和HE染色試劑盒（G1120）均購自Solarbio；甲醛（SSBT，SS24273）；PBS（聯邁生物，LM0221 A）；microRNA熒光定量PCR試劑盒（KALANG，KL190）；蛋白酶K溶液（源葉，R21066）；二甲苯（古朵，GD-RY1215-12）；TRIzol LS試劑（Invitrogen，10296010）；2× SYBR Green qPCR Master Mix（Labio，LBS201）；水合氯醛（經科，JKLN006718）；TdT酶緩沖液（JR01891）和TdT酶反應液（JR01888）均購自上海君瑞；Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，E1910）；抗 phospho-SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）抗體（9255）、抗絲裂原活化的蛋白激酶激酶激酶激酶3（mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 3，MAP4K3）抗體（92427）、抗 phospho-SEK1/MKK4（Ser257）抗體（514）、抗膠質細胞原纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（80788）、抗 cleaved PARP（Asp214）抗體（5625）和cleaved caspase-3（Asp175）抗體（9661）均購自Cell Signaling Technology）。HEK293T細胞（ATCC，CMH010）。

2.2 實驗儀器 凈化工作臺（Boxun，SW-CJ-2FD）；生物顯微鏡（OLYMPUS，BX43）；恒溫培養箱（DAIHAN，WIG-105）；PCR擴增儀（ABI，7900型）；倒置熒光顯微鏡（Nikon，Ti2系列）。

3 主要方法

3.1 ICH建模 隨機選取40只SD大鼠注射10%水合氯醛麻醉，置于俯臥位，固定于立體定向架上。用牙鉆（顱骨前0.2 mm、中線靠右3 mm）鉆出一個1 mm的小孔，微量進樣器緩慢垂直進針5.6mm，定位于近內囊的蒼白球內。將2 μLⅦ型膠原酶（0.5 UⅦ型膠原酶用2 μL生理鹽水稀釋）以0.4 μL/min的速度注入，留針5min后緩慢拔出，ICH模型構建成功。剩余8只SD大鼠作為假手術（sham）組。

3.2 分組及處理 將造模后的ICH大鼠隨機分為5組：model組、let-7a agomir組、NC agomir組、let-7a antagomir和NC antagomir組，每組8只。在側腦室鉆一個1 mm的毛刺孔（顱骨后0.8 mm，中線右側1.5 mm，4.5 mm 深的位置），將 10 μmol/L的 let-7a agomir、NC agomir、let-7a antagomir和NC antagomir以0.5 μL/min的速度各注射5μL。造模7 d后，由3名不知情觀察人員對所有大鼠的神經功能進行評分。評分標準由運動、感覺、反射和平衡測試組成，參照Zea-Longa的分級標準進行評分。計算平均值和標準差。實驗過程中各組均無動物死亡。

3.3 細胞的培養和轉染 將HEK293T細胞培養在含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中進行培養。根據LipofectamineTM2000說明書，轉染前將細胞以每孔5×105細胞的密度接種于6孔板，孵育過夜。將let-7a mimic或NC mimic轉染到HEK293T細胞，培養24 h后進行后續實驗。

3.4 HE染色觀察病理損傷 取大鼠血腫周圍腦組織，制作為10 μm厚的切片，每個實驗組選取5個切片，進行HE染色分析。根據HE染色試劑盒說明書進行染色。首先固定切片，沖洗，并用蘇木精和伊紅染色。切片在梯度乙醇下逐漸脫水，充分干燥，用中性樹脂密封，最后在光學顯微鏡下觀察。

3.5 RT-qPCR檢測相關RNA相對表達水平 將腦組織在液氮中研磨成粉末，100 mg組織加入1 mL TRIzol LS提取總RNA。使用TRIzol LS試劑提取星形膠質細胞中的總RNA。用分光光度計測定RNA濃度和純度。將逆轉錄反應產物與2×SYBR Green Master Mix（Labio）結合，使用ABI 7900型PCR擴增儀擴增，反應體系為10 μL。PCR條件為：95℃10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環。循環閾值（cycle threshold，Ct）＞38被定義為無法檢測。使用2-ΔΔCt法計算試驗組和對照組樣品之間的相對倍數變化。每組重復3次。GFAP的上游引物序列為5'-CTCAATGCTGGCTTCAAGGAGA-3'，下游引物序列為5'-GACGCAGCGTCTGTGAGGTC-3'；let-7a的上游引物序列為5'-AGGATCCAAAGGTGGTGGTAAGAGGGTGAT-3'，下游引物序列為5'-AGTCGACATAAGACAAGAAGCAAAAGGTTT-3'；MAP4K3的上游引物序列為5'-GCAAAGCCATCCCAAGTT-3'，下游引物序列為5'-GTGCCTCTATGTTCATTCTGTT-3'；內參照U6的上游引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

3.6 Western blot檢測相關蛋白的水平 提取各組腦組織蛋白質，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，然后轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上。在室溫下用5%BSA在TBS中封膜1 h。用I抗[GFAP（1∶1 000）、MAP4K3（1∶1 000）、JNK（1∶2 000）、MKK4（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、cleaved PARP（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 200）]在 TBST（TBS中含 0.1%Tween-20）中與PVDF膜4℃培養過夜，然后在室溫下與相應II抗孵育2 h。提取40 μg蛋白質用化學發光法進行檢測。GAPDH為內參照。最后用蛋白圖像處理軟件和Quantity One軟件分別掃描X膠片和條帶灰度。本實驗重復3次。

3.7 TUNEL染色檢測神經元凋亡情況 斷頸處死大鼠，取神經組織制作為10 μm厚的切片，每個實驗組選取5個切片，進行TUNEL染色分析。將切片置于染色缸中，用二甲苯洗滌2次，每次5 min；無水乙醇洗滌2次，每次3 min；95%乙醇和75%乙醇3 min各洗1次；用PBS洗滌2次，每次5 min。加入蛋白酶K溶液（20 mg/L）水解20 min，去除蛋白。蒸餾水洗4次。色缸中加入含有2%過氧化氫的PBS，反應15 min；PBS洗滌2次，每次5 min。用濾紙吸去切片上多余液體，添加2滴TdT酶緩沖液放置3 min；用濾紙吸去多余液體，立即添加50～80 μL的TdT酶反應液，37℃孵育1 h；PBS洗滌3次，每次5 min。加入轉化劑-POD孵育25 min；PBS洗滌4次，每次5 min。加入5%DBA底物溶液，顯色5～10 min；蒸餾水洗滌4次，每次1 min。甲基綠復染10 min，蒸餾水洗滌3次，正丁醇洗滌3次，最后用二甲苯脫水3次，每次2 min。中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察結果。采用ImageJ軟件來統計每張圖片上的細胞總數（包括凋亡和未凋亡的細胞）和呈現棕黃色的凋亡細胞數。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

3.8 let-7a與MAP4K3的靶向關系 使用生物信息學軟件TargetScan對let-7a和MAP4K3的靶向關系進行預測和分析，并用Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測螢光素酶活性，進一步驗證靶向關系。用PCR擴增含有let-7a結合位點的MAP4K3基因的3'UTR序列。將MAP4K3的3'UTR克隆到pMIR-REPORT螢光素酶載體中，成為pMIR-MAP4K3-WT。通過PCR擴增MAP4K3 3'UTR結合位點的突變，同樣克隆到pMIR-REPORT載體中，成為pMIRMAP4K3-MUT。根據LipofectamineTM2000說明書將let-7a mimic/NC mimic和pMIR-MAP4K3-WT/pMIRMAP4K3-MUT共轉染到HEK293T細胞中。轉染48 h后，用PBS清洗細胞2次，在每孔細胞中加入100 μL裂解緩沖液（Passive Lysis Buffer，PLB），室溫下震蕩15 min，收集細胞裂解液。取20 μL PLB加入發光板中，用GloMax生物發光檢測儀讀取背景值；每個樣本加入100 μL LAR II工作液，快速混勻、讀值；每個樣本再加入 100 μL Stop＆Glo Reagent，快速混勻后，放入發光板中檢測、讀值。每個樣本重復3次。

4 統計學處理

用SPSS 22.0進行統計學分析，實驗數據用均數±標準差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析后，再用SNK-q檢驗進行各組均數間的兩兩比較，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 let-7a過表達降低了神經功能評分

利用神經功能評分和HE染色觀察病理損傷。結果顯示，let-7a agomir組的神經功能評分較模型組和 NC agomir組顯著降低（P＜0.05），而 let-7a antagomir組的評分則明顯高于模型組和NC antagomir組（P＜0.05），見圖1A。RT-qPCR檢測大鼠血腫周圍腦組織let-7a表達水平顯示，let-7a agomir組中let-7a表達水平比模型組和NC agomir組增加了數倍（P＜0.01），而let-7a antagomir組相比模型組和NC antagomir組let-7a表達水平明顯降低（P＜0.05），見圖1B。從HE染色可以看出，與模型組和NC agomir組相比，let-7a agomir組的病理損傷最輕，而與模型組和NC antagomir組相比，let-7a antagomir組的病理損傷最嚴重。上述結果表明，let-7a過表達降低了神經功能評分，減輕了腦組織病理損傷。

Figure 1.Protective effect of let-7a over-expression on the rat brain tissues.A：the neurological function score；B：the expression of let-7a was detected by RT-qPCR；C：the brain injury observed by HE staining.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖1 let-7a過表達對大鼠腦組織的保護作用

2 let-7a過表達降低了GFAP表達水平

由于星形膠質細胞活化是引起ICH的重要原因之一。因此，本研究利用RT-qPCR和Western blot檢測星形膠質細胞活化標志物GFAP的表達水平，以判斷ICH后的繼發性損傷。結果顯示，與模型組和NC agomir組相比，let-7a agomir組的GFAP表達水平顯著降低（P＜0.05），而let-7a antagomir組卻明顯高于模型組和NC antagomir組（P＜0.05），見圖2。這說明let-7a過表達降低了GFAP的表達水平。

3 let-7a過表達減少神經元凋亡

利用TUNEL染色檢測各組神經元凋亡情況；RT-qPCR和Western blot檢測let-7a表達水平對ICH后cleaved caspase-3和cleaved PARP蛋白水平的影響。結果顯示，let-7a antagomir組TUNEL陽性細胞數明顯增加（P＜0.05）；而let-7a agomir組正好相反，陽性細胞數明顯減少（P＜0.05），見圖3A。let-7a antagomir組cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平明顯高于模型組和NC antagomir組（P＜0.05），而let-7a agomir組cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平明顯低于模型組和NC agomir組（P＜0.05），見圖3B。這些結果表明，let-7a過表達可以減少神經元凋亡，使cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平下調。

Figure 2.let-7a over-expression reduced GFAP expression.A：GFAP mRNA expression level was detected by RT-qPCR；B：GFAP protein expression level was detected by western blot.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs model group.圖2 let-7a過表達降低了GFAP的表達水平

4 let-7a和MAP4K3的靶向關系

通過生物信息學軟件TargetScan對let-7a和MAP4K3的靶向關系進行預測和分析，結果顯示，MAP4K3 3’-UTR的1056～1068 bp區域存在has-let-7a-5p的潛在結合位點，說明MAP4K3是let-7a的靶基因之一，見圖4A。將let-7a mimic和NC mimic轉染到HEK293T細胞，RT-qPCR檢測顯示，let-7a組中let-7a的表達顯著升高（P＜0.01），MAP4K3的表達顯著降低（P＜0.05），說明let-7a過表達抑制了MAP4K3的表達，見圖4B。利用雙螢光素酶報告基因實驗進一步驗證let-7a和MAP4K3的靶向關系，結果顯示，let-7a mimic組的MAP4K3野生型組螢光素酶活性顯著低于突變型組（P＜0.05），說明let-7a和MAP4K3之間的靶向關系為負向調控，見圖4C。上述實驗結果表明，MAP4K3是let-7a的靶基因之一，且兩者為負調控。

5 let-7a靶向MAP4K3抑制MKK4/JNK通路的活化

提取腦組織蛋白，利用Western blot檢測MAP4K3、MKK4和JNK的表達水平。結果顯示，let-7a agomir組中 MAP4K3、p-MKK4/MKK4和 p-JNK/JNK的蛋白水平明顯低于對照組和NC agomir組；let-7a antagomir組的相關蛋白水平顯著高于對照組和NC antagomir組（P＜0.05），見圖5。這說明let-7a靶向MAP4K3能夠抑制MKK4/JNK通路的活化。

討 論

miRNA的失調與許多人類疾病有關[6]，在大腦中，miRNA參與控制神經元凋亡、程序性細胞死亡過程。let-7a是一種腫瘤抑制miRNA，具有調節炎癥小膠質細胞功能[7]，表達模式在小鼠、大鼠和人類的神經分化中比較保守[8]。let-7a在蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷中具有保護作用[9]，可以抑制ICH小鼠促炎細胞因子的表達，減輕腦水腫，改善神經功能[10]。本研究用大鼠ICH模型檢測了let-7a的表達水平對大鼠神經功能的影響，結果顯示let-7a高表達時，神經功能評分降低，腦組織病理損傷減輕。但let-7a表達水平的調控在ICH發病機制中的作用尚不清楚。

Figure 3.let-7a over-expression reduced neuronal apoptosis and decreased apoptosis-related protein levels.A：the neuronal apoptosis was detected by TUNEL staining；B：the apoptosis-related protein levels were detected by Western blot.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs model group.圖3 let-7a過表達減少神經元凋亡并降低凋亡相關蛋白的水平

Figure 4.Targeting relationship between let-7a and MAP4K3.A：the target gene of let-7a was predicted by TargetScan；B：the expression levels of let-7a and MAP4K3 were detected by RT-qPCR；C：targeting relationship was detected by dual-luciferase reporter assay.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC mimic group.圖4 let-7a和MAP4K3的靶向關系

Figure 5.let-7a targeted MAP4K3 to inhibit MKK4/JNK pathway activation.The protein expression levels were detected by Western blot.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖5 let-7a靶向MAP4K3抑制MKK4/JNK通路的活化

GFAP是一種Ⅲ型中間絲狀蛋白，以單體形式存在，是星形膠質細胞活化的標志物。GFAP在大腦發育、細胞凋亡和疾病中有著重要的作用[11]，抑制成熟腦的神經元增殖和神經元突起擴展，形成隔離受損組織的物理屏障，促進血腦屏障[12]。GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP被認為是腦中不良組織反應的分子標志物和早期指標[13-14]，提示凋亡和神經炎癥參與延遲血腦屏障和微血管損傷的機制，導致蛋白質改變[15]。因此，本研究利用RT-qPCR和Western blot檢測了let-7a表達水平對ICH后GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP的影響，并用TUNEL染色檢測了神經元凋亡情況。結果顯示，let-7a過表達降低了GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平，TUNEL陽性細胞數也明顯減少，這與之前的研究相似[13-15]，說明let-7a過表達抑制GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP的水平，減少神經元凋亡。

MAP4K3屬于哺乳動物Ste20樣絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，家族成員有MAP4K1/HPK1、MAP4K2/GCK、MAP4K3/GLK、MAP4K4/HGK、MAP4K5/KHS、MAP4K6/MINK 等[16]。MAP4K3在肝癌中參與腫瘤細胞的存活、凋亡和自噬[17-18]；促進胰腺癌[19]、鱗癌[20]和乳腺癌[21]細胞的凋亡，具有抑癌作用。研究發現，MAP4K3在多系統腦萎縮（multiple system atrophy，MSA）中過表達；在黑色素瘤中let-7a通過下調MAP4K3抑制黑色素瘤細胞的生長和侵襲性[22]。但在ICH中沒有被提及和研究。因此，本研究利用生物信息學軟件對let-7a與MAP4K3的靶向關系進行了預測，進一步用雙螢光素酶報告基因實驗驗證了靶向關系，并將let-7a mimic或NC mimic轉染到HEK293T細胞，RT-qPCR檢測了MAP4K3和let-7a的表達水平。結果顯示，MAP4K3是let-7a的靶基因之一，且兩者之間為負調控關系。這與在黑色素瘤中的研究相似[23]，說明let-7a通過下調MAP4K3來抑制ICH后神經元的凋亡。

JNK參與哺乳動物細胞的多種生物學功能，包括凋亡和應激反應[26]。MKK4控制細胞生長和衰老[25]。研究發現，MEKK1通過JNK通路抑制ICH后神經元的凋亡[24]。JNK信號通路在甲狀腺乳頭狀癌中被研究[27]，但在ICH相關疾病中未被提及或研究。為了解MKK4/JNK信號通路在ICH中的分子機制，本研究利用Western blot檢測了腦組織MAP4K3、MKK4和JNK的表達情況。結果顯示，let-7a過表達降低了MAP4K3、MKK4和JNK的表達。

綜上所述，let-7a通過抑制MAP4K3/MKK4/JNK信號通路減輕ICH大鼠的神經元凋亡。這一結果預示let-7a有望成為新的ICH治療靶點，但其更為詳細的分子機制還有待進一步研究。