rhPGRN通過MAPK/PI3K通路調控自噬和內質網應激并促進細胞增殖*

羅 瑞，秦啟忠，劉 敏，尹丹旸，郭風勁

（重慶醫科大學基礎醫學院細胞生物學與遺傳學教研室，發育生物學與模式動物平臺，重慶400016）

生長因子顆粒體蛋白前體（progranulin，PGRN）由GRN基因編碼，是含有593個氨基酸的分泌性糖蛋白，分泌到細胞外后以完整形態或者水解后的組成肽形式發揮功能[1-2]。研究證實PGRN與發育、組織修復再生、腫瘤發生、神經營養和炎癥密切相關，并且能調控多種溶酶體酶活性[3-4]。PGRN在神經元和免疫細胞中大量表達，并且在乳腺癌、腎透明細胞癌、骨肉瘤、阿爾茨海默病和其它神經退行性疾病中表達顯著增高[1-2，5]。GRN基因的突變涉及了很多常見的疾病包括額顳葉癡呆和神經元蠟樣脂褐質沉著癥，目前PGRN作為一種生長因子被證實對神經系統疾病和溶酶體貯積病具有治療作用[3]。文獻報道[2，6-7]，通過重組PGRN或其衍生的工程化蛋白Atsttrin的局部遞送可以在手術誘導的骨關節炎（osteoarthritis，OA）模型中有效抑制炎癥，減少軟骨基質的降解，減緩OA樣表型的進一步發展，并且在非手術誘導的大鼠中表現出對OA的預防效果。已有實驗顯示轉染pHis/Myc-PGRN質粒的穩定293細胞株，細胞增殖速度顯著增加[8]。同時，PGRN還可以通過激活股骨頭壞死患者體內軟骨組織分離的軟骨細胞ERK1/2通路，上調聚集蛋白聚糖（aggrecan，ACN）和II型膠原（collagen type II，Col II）的表達，改善軟骨細胞合成代謝的能力，但具體機制尚不明確[4，9]。

本研究首先構建含有His標簽的PGRN穩轉細胞株，進而利用這一穩轉細胞株獲得具有生物活性的人源重組蛋白rhPGRN。His標簽一般由6～12個氨基酸殘基組成，作為一種常用的蛋白質純化親和標簽，在蛋白質純化方法中日益受到重視[10-11]。重組蛋白N端組氨酸殘基上的咪唑基團能與Ni2+、Co2+和Ca2+等金屬離子形成配位鍵并隨固相載體中的螯合化合物如亞氨基二乙酸（iminodiacetic acid，IDA）或氨三乙酸（nitrilotriacetic acid，NTA）分離，通過咪唑溶液競爭性洗脫，可以得到約90%或者更高純度的重組蛋白；同時，His標簽可作為重組蛋白的識別標記[11-13]。我們通過大批量培養這一穩轉細胞株，獲得具有生物活性的重組蛋白，首先通過BCA方法及Western blot檢測該重組蛋白的濃度與純度；進一步通過細胞計數、Western blot和RT-qPCR等方法探討其對人軟骨細胞C28I2和小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖、自噬和內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的影響，以期為后續深入研究PGRN生物學功能、開發生物制劑提供參考資料。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞 293-PGRN穩轉細胞株和C28I2細胞均由紐約大學醫學院劉傳聚教授饋贈；RAW264.7細胞購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑 Ni-NTA resin beads購自Novex；細胞培養液購自Gibco；細胞培養皿購自NEST；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自PAN；G418購自BioFroxx；青、鏈霉素溶液和BCA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；PGRN抗體購自Abcam；ERK、p-ERK、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）-I/-II、蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和需肌醇酶 1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）抗體購自CST；p-Akt、P62、剪接型X盒 結 合 蛋 白 1（spliced X-box binding protein 1，XBP1s）和Ki67抗體及ECL超敏化學發光液購自Affinity；β-actin抗體購自ABclonal；羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購自博士德生物工程有限公司；U0126、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1，Baf-A1）和4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）購自Sigma。

2 方法

2.1 細胞培養 C28I2和RAW264.7細胞使用含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%FBS的DMEM培養液在37℃、5%CO2細胞培養箱中常規培養。PGRN穩轉細胞株加入100 mg/L的篩選抗生素G418，其余培養條件相同。

2.2 rhPGRN重組蛋白的純化與鑒定 PGRN穩轉細胞培養至150 mm培養皿，匯合度達到95%以上后，更換為25 mL無FBS DMEM培養液繼續培養72 h，然后收集細胞培養液，100×g離心3 min后收集細胞上清液。取1 mL Ni-NTA resin beads，加入5 mL去離子水，100×g離心3 min棄去上清，重復3次，同樣條件再使用5 mL Native buffer漂洗2次。每管resin beads加入2 mL DMEM培養液混勻后加入細胞上清液中，4℃層析柜內旋轉培養器上旋轉過夜。離心后收集resin beads入離心管內，加入20 mL預冷的Native buffer旋轉 5 min，4℃、100×g離心3 min，重復3次。分別使用6 mL、6 mL、4 mL、4 mL預冷的Elution buffer進行洗脫，4℃旋轉8 min，100×g離心3 min，收集4次的濾液使用無菌濾膜過濾至超濾柱內。4℃、4 000×g離心8 min，再加入2 mL無菌PBS，同等條件離心8 min，收集上層液體即為rhPGRN，-80℃保存。用BCA試劑盒、考馬斯亮藍染色和Western blot測定rhPGRN的濃度和純度。

2.3 C28I2和RAW264.7細胞增殖的變化 將對數生長期的C28I2和RAW264.7細胞分別以每孔2.5×104和0.5×105的密度接種于24孔板中，每組3個復孔，細胞培養液中分別加入100和200 μg/L rhPGRN，每24 h更換培養液并加入rhPGRN，細胞匯合度達到80%后傳代至6孔板。分別在2 d、3 d、4 d、5 d用胰酶消化制成細胞懸液，使用細胞計數板計數。細胞數量為計數板4個大格細胞平均數×107/L。

2.4 Western blot檢測增殖、自噬和ERS相關蛋白的表達 細胞匯合度達到80%以后，細胞換用無FBS培養液，培養24 h，使用rhPGRN分別處理0、10、30和120 min后檢測增殖相關蛋白表達；其余組換用含10%FBS的培養液，使用rhPGRN、3-MA、4-PBA、Baf-A1和U0126分別處理不同組細胞。各組處理的C28I2和RAW264.7細胞中加入1 mL RIPA裂解液后收集裂解液超聲破碎，11 500×g離心15 min，收集上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入SDS蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。12%聚丙烯酰胺凝膠中每孔上樣20 μg，120 V恒壓電泳，100 V恒壓轉膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜后4℃孵育Ⅰ抗過夜。TBST洗膜后加入Ⅱ抗常溫孵育120 min，硝酸纖維素膜上滴加超敏ECL發光液，暗室膠片曝光。

2.5 RT-qPCR檢測細胞周期相關分子的mRNA表達 C28I2和RAW264.7細胞鋪皿后待細胞貼壁，使用rhPGRN單獨或聯合U0126處理24和48 h。首先進行細胞計數，離心后棄去上清，各組細胞加入1 mL裂解液RL，收集裂解物置于無酶EP管，4℃、11 500×g離心10 min，上清液中加入0.2 mL三氯甲烷，振蕩15 s，孵育3 min，同樣條件離心。取最上層液體加等體積70%乙醇，混勻后加入吸附柱RA中9 500×g離心45 s，分別用500 μL漂洗液RW、去蛋白RE、漂洗液RW洗1次。將吸附柱RA放入無酶EP管中并加入20 μL RNase-free water，11 500×g離心1 min，測濃度后逆轉錄為cDNA。PCR反應條件為：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共39個循環。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primer for RT-qPCR

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 6進行統計分析。實驗數據均以均數±標準差（mean±SD）表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 rhPGRN的提取與鑒定

通過Ni-NTA瓊脂糖樹脂親和純化帶有His標簽的重組蛋白，使用咪唑溶液洗脫后再進行考馬斯亮藍染色，結果顯示目的蛋白rhPGRN分子量約為88 kD，與預期相符，純度大于95%，另有兩次提取的rh-PGRN發生降解，主要降解片段分子量約為72 kD，見圖1A。通過BCA法檢測蛋白濃度并繪制蛋白濃度標準曲線為y=1.564 4x+0.112 2（R2=0.998 4），測得rhPGRN濃度約為0.44 g/L和0.23 g/L，見圖1B。Western blot結果表明，該重組蛋白能與PGRN抗體特異性結合，降解部分幾乎不能與抗體結合，見圖1C。

2 rhPGRN促進C28I2和RAW264.7細胞的增殖

在C28I2細胞培養液中加入rhPGRN（100 μg/L），處理48 h后與對照組相比細胞數量顯著增加（P＜0.01）；而RAW264.7細胞加入rhPGRN（200 μg/L）后24 h即觀察到細胞數量顯著增加（P＜0.05），見圖2。

Figure 1.Identification of rhPGRN purity and concentration.A：Coomassie blue staining results（1～2：different batches of rhPGRN；3～4：degraded rhPGRN；5～7：0.5，0.2 and 0.1 g/L standard protein）；B：protein standard curve；C：Western blot was used to detect the purified rhPGRN（1～3：different batches of rhPGRN）.圖1 rhPGRN的純度及濃度鑒定

Figure 2.Effect of rhPGRN on proliferation of C28I2 and RAW264.7 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 rhPGRN對C28I2和RAW264.7細胞增殖的影響

3 rhPGRN對C28I2和RAW264.7細胞周期相關分子mRNA和蛋白表達的影響

在C28I2細胞，rhPGRN處理24 h后，增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、cyclin B1和cyclin D1的mRNA表達均顯著上調（P＜0.01），處理48 h后，cyclin B1的mRNA表達持續上調（P＜0.01），而PCNA和cyclin D1的mRNA表達則較 0 h時無顯著差異（P＞0.05）；rhPGRN 處理RAW264.7細胞24及48 h后，PCNA、cyclin B1和cyclin D1的mRNA表達水平均顯著上調（P＜0.05或P＜0.01），見圖3A、B。Western blot結果顯示，rhPGRN處理C28I2和RAW264.7細胞24和48 h后，細胞周期相關蛋白Ki67的表達均顯著上調（P＜0.05或P＜0.01），見圖3C、D。

4 rhPGRN對C28I2和RAW264.7細胞MAPK和PI3K/Akt信號通路的影響

在C28I2細胞中，rhPGRN處理10 min后p-Akt、p-ERK和ERK蛋白水平均顯著增加，并在rhPGRN處理10 min后達到峰值（P＜0.01），隨著rhPGRN處理時間延長，p-Akt、p-ERK和ERK蛋白水平逐漸降低，p-ERK相對水平（p-ERK/ERK）在120 min的處理時間內持續增高（P＜0.01），見圖4A。RAW264.7細胞經rhPGRN處理30 min后p-Akt、p-ERK和ERK蛋白水平均達到峰值，隨后逐漸降低，p-ERK相對水平在120 min時達到峰值（P＜0.01），見圖4B。

5 rhPGRN通過調控MAPK信號通路促進細胞的增殖

進一步用ERK通路抑制劑U0126聯合rhPGRN分別處理C28I2和RAW264.7細胞，檢測細胞增殖相關各項數據。結果顯示，C28I2細胞中，與rhPGRN單獨處理24 h組相比，U0126+rhPGRN處理24 h后，PCNA、cyclin B1和cyclin D1的mRNA表達下調（P＜0.05或P＜0.01），Ki67蛋白水平下降（P＜0.05）；與rhPGRN單獨處理48 h組相比，U0126+rhPGRN處理48 h后，cyclin B1和cyclin D1的mRNA表達顯著下調（P＜0.05或P＜0.01），Ki67蛋白水平下降（P＜0.05），細胞數量顯著降低（P＜0.05），見圖 5A～C。RAW264.7細胞中，與rhPGRN單獨處理24 h組相比，U0126+rhPGRN處理24 h后PCNA、cyclin B1和cyclin D1的 mRNA表達下調（P＜0.05或P＜0.01），Ki67蛋白水平顯著降低（P＜0.01）；與rhPGRN單獨處理48 h組相比，U0126+rhPGRN處理48 h后PCNA、cyclin B1和cyclin D1 mRNA水平下調（P＜0.05或P＜0.01），Ki67蛋白表達下調（P＜0.01），細胞數量顯著降低（P＜0.05），見圖5D～F。

Figure 3.Effect of rhPGRN on the mRNA and protein expression of cell cycle-related molecules.A：RT-qPCR analysis of the mRNA expression of PCNA，cyclin B1 and cyclin D1 in C28I2 cells treated with 100 μg/L rhPGRN；B：RT-qPCR analysis of the mRNA expression of PCNA，cyclin B1 and cyclin D1 in RAW264.7 cells treated with 200 μg/L rhPGRN；C：the protein level of Ki67 in C28I2 cells was detected by Western blot；D：the protein level of Ki67 in RAW264.7 cells was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h group.圖3 rhPGRN對C28I2和RAW264.7細胞周期相關分子mRNA和蛋白表達的影響

Figure 4.Effect of rhPGRN on proliferation-related signaling pathways.The protein levels of p-Akt，p-ERK and ERK in rhPGRN-treated C28I2 cells（A）and RAW264.7 cells（B）were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 min group.圖4 rhPGRN對C28I2和RAW264.7細胞增殖相關信號通路的影響

6 rhPGRN誘導細胞自噬和ERS依賴于MAPK信號通路

用U0126聯合rhPGRN分別處理C28I2和RAW264.7細胞，并檢測自噬和ERS相關蛋白表達。結果顯示，rhPGRN處理組LC3-Ⅱ表達上調且P62蛋白水平降低，ERS標志蛋白PERK、IRE1和XBP1s表達上調（P＜0.05或P＜0.01）；與rhPGRN單獨處理組相比，U0126+rhPGRN組LC3-Ⅱ表達下調，P62表達上調，C28I2細胞中IRE1和XBP1s表達下調，RAW264.7細胞中PERK、IRE1和XBP1s的表達均顯著下調（P＜0.05），見圖6。

7 rhPGRN通過PI3K/Akt信號通路調控細胞自噬與ERS

進一步采用PI3K/Akt通路抑制劑3-MA聯合rh-PGRN分別處理C28I2和RAW264.7細胞，并檢測自噬和ERS相關蛋白表達。結果顯示，與rhPGRN單獨處理組相比，3-MA+rhPGRN處理組LC3-Ⅱ表達下調，P62表達上調（P＜0.05或P＜0.01），C28I2細胞中XBP1s表達顯著降低（P＜0.05），RAW264.7細胞中ERS標志蛋白IRE1、XBP1s和PERK的表達均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖7。

8 rhPGRN通過調控細胞自噬和ERS促進細胞增殖

采用自噬抑制劑Baf-A1或ERS抑制劑4-PBA與rhPGRN聯合處理C28I2和RAW264.7細胞，結果顯示，與rhPGRN單獨處理組相比，Baf-A1+rhPGRN處理組和4-PBA+rhPGRN處理組細胞增殖標志蛋白Ki67表達均下調（P＜0.05或P＜0.01），見圖8。

討 論

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）、OA以及其它關節病的滑膜液中均檢測到了PGRN的水平升高；PGRN被證實可以通過拮抗TNF-α信號傳導來保護軟骨細胞的分解代謝，在骨折組織中PGRN依賴TNFR2增強軟骨骨化，發揮促進骨愈合、增強骨再生的作用[6，14]。軟骨細胞中，PGRN可以通過激活ERK1/2信號傳導和JunB轉錄因子控制軟骨形成，此過程由上游分子BMP2參與調控，ERK1/2信號傳導還能激活軟骨細胞分化[2，4]。PGRN對炎癥狀態下巨噬細胞的募集具有重要作用，可以促進炎癥部位中性粒細胞和巨噬細胞聚集，其機制可能是通過與TNFR1結合，調節相關趨化因子水平[15]。目前已經開發了多種PGRN的靶向策略，包括使用胺碘酮促進PGRN表達，通過真核質粒、腺病毒、慢病毒載體過表達GRN基因，直接注射或者利用3D打印支架釋放重組蛋白，其中一些方法已經進入了臨床試驗[16-19]。本研究通過His標簽蛋白純化法提取和純化具有生物活性的人源重組蛋白rhPGRN，并結合細胞計數和細胞增殖相關標志基因的檢測，觀察到rhPGRN不僅對人源軟骨細胞C28I2具有促增殖作用，對鼠源巨噬細胞RAW264.7同樣具有促進細胞增殖的作用，只是在不同類型細胞中rhPGRN重組蛋白對增殖相關標志基因時空表達譜的影響具有一定差異性。

PI3K/Akt信號通路調節基本的細胞功能，包括細胞生長、增殖和細胞周期；ERK1/2信號通路同樣參與多種生命過程的調節，包括細胞黏附、細胞周期進程、細胞遷移、細胞存活、分化、增殖和轉錄[20-23]。為了進一步研究rhPGRN促進細胞增殖的機制，接下來我們探討了rhPGRN是否影響MAPK和PI3K/Akt這兩條參與細胞增殖的信號通路。在本研究中，我們觀察到rhPGRN通過短暫激活ERK和Akt的磷酸化發揮促增殖作用，并且rhPGRN的這一促增殖作用在加入ERK信號通路抑制劑U0126后被顯著抑制，說明rhPGRN對C28I2和RAW264.7細胞的促增殖作用至少部分依賴于MAPK信號通路。

細胞自噬和ERS是維持細胞內穩態，保護細胞存活的一種機制，通過調控細胞的增殖和凋亡實現對細胞穩態的維持，過度的自噬會導致細胞啟動自噬性死亡程序，而過度ERS會導致細胞凋亡[24-25]。我們進一步探討rhPGRN是否通過上述的MAPK/PI3K細胞增殖信號通路調控自噬和ERS。結果顯示，rhPGRN可以激活自噬和ERS，采用PI3K/Akt通路抑制劑3-MA后，rhPGRN促進自噬的作用被抑制，顯示rhPGRN可能通過PI3K/Akt通路激活細胞自噬；rhPGRN誘導的自噬和ERS均可被U0126抑制，提示rhPGRN通過MAPK信號通路促進細胞自噬和ERS。最后，我們還觀察到，與rhPGRN組相比，rhPGRN+Baf-A1組和rhPGRN+4-PBA組增殖相關蛋白Ki67表達均被抑制。一些相關研究也報道了類似的結果，Chen等[26]的研究觀察到自噬抑制劑氯喹顯著抑制了大鼠肝卵圓細胞增殖；Ishimura等[27]通過ERS抑制劑4-PBA和?；切苋パ跄懰崽幚盹@著抑制了人血小板衍生生長因子誘導的人冠狀動脈平滑肌細胞的增殖和遷移。因此，本研究提示rhPGRN可能通過MAPK/PI3K信號通路調控細胞自噬和ERS，促進細胞的增殖。

Figure 5.Effect of U0126 treatment on rhPGRN-induced cell proliferation.A：RT-qPCR results of different groups of C28I2 cells treated with 10 μmol/L U0126 and 100 μg/L rhPGRN；B：C28I2 cell counting results of different groups；C：the expression of Ki67 in C28I2 cells was determined by Western blot；D：RT-qPCR results of different groups of RAW264.7 cells treated with 10 μmol/L U0126 and 200 μg/L rhPGRN；E：RAW264.7 cell counting results of different groups；F：the expression of Ki67 in RAW264.7 cells was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（0 h）group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs rhPGRN（24 h）group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs rhPGRN（48 h）group.圖5 U0126處理對rhPGRN誘導的C28I2和RAW264.7細胞增殖的影響

Figure 6.Effect of U0126 treatment on rhPGRN-induced autophagy and ERS.A：the levels of autophagy-and ERS-related proteins in C28I2 cells treated with 10 μmol/L U0126 and 100 μg/L rhPGRN were detected by Western blot；B：the levels of autophagy-and ERS-related proteins in RAW264.7 cells treated with 10 μmol/L U0126 and 200 μg/L rhPGRN were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs rhPGRN group.圖6 U0126處理對rhPGRN誘導的C28I2和RAW264.7細胞自噬和ERS的影響

Figure 7.Effects of 3-MA on rhPGRN-induced autophagy and ERS.A：the levels of autophagy-and ERS-related proteins in C28I2 cells treated with 5 μmol/L 3-MA and 100 μg/L rhPGRN were detected by Western blot；B：the levels of autophagy-and ERS-related proteins in RAW264.7 cells treated with 5 μmol/L 3-MA and 200 μg/L rhPGRN were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs rhPGRN group.圖7 3-MA對rhPGRN誘導的C28I2和RAW264.7細胞自噬和ERS的影響

Figure 8.Effect of Baf-A1 and 4-PBA treatment on rhPGRN-induced proliferation of C28I2 cells（A）and RAW264.7 cells（B）.The effects of 0.5 μmol/L Baf-A1 and 5 mmol/L 4-PBA on Ki67 expression were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs rhPGRN group.圖8 Baf-A1和4-PBA處理對rhPGRN誘導的C28I2和RAW264.7細胞增殖的影響

最近的研究還報道了PGRN通過PI3K/Akt途徑促進膽管癌細胞增殖[28]；通過TNFR2/Akt和ERK信號傳導途徑促進結腸癌細胞增殖[29]；在人胃上皮細胞和人調節性T細胞中也被證實具有促增殖作用[30-31]；GRN基因的特異性沉默抑制了非小細胞肺癌A549細胞增殖及遷移能力[32]；在人角質形成細胞中，PGRN被證實通過Wnt/β-Catenin信號傳導通路抑制炎癥并促進細胞自噬[33]；在脂肪細胞中，PGRN可以通過激活ERS引起自噬增加，引發脂肪細胞胰島素抵抗，在肝臟細胞中也觀察到自噬和ERS的緊密聯系[34-35]。本研究通過培養PGRN穩轉細胞株獲得了活性rhPGRN蛋白，作用于兩種不同類型的細胞驗證其促增殖、自噬和ERS的生物學功能，并探討了這些效應與MAPK/PI3K通路的關系。

綜上所述，本研究成功提取出較高純度的人源重組蛋白rhPGRN，并證實rhPGRN通過MAPK/PI3K信號通路調控細胞自噬和ERS，促進C28I2和RAW264.7兩種不同類型細胞的增殖，為后續rhPGRN相關藥物的研發奠定了基礎。