桑寄生提取物聯合miR-375對骨關節炎軟骨細胞活力和凋亡的影響*

卓澤銘，范忠誠，郭 祥

（中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院骨科，海南?？?70208）

骨關節炎是一種以關節軟骨退化、滑膜炎癥、軟骨下骨增厚和骨贅形成為特征的慢性退行性關節疾病，是與關節創傷和衰老相關的最常見的關節疾病[1]。目前，骨關節炎藥物治療方案仍然有限，非藥物治療方案亦未得到充分利用[2]。因此，迫切需要擴大研究，以便更充分地探索基于骨關節炎機制的疼痛管理策略。桑寄生（Herba Taxilli，Sangjisheng，SJS）是桑寄生科植物桑寄生[Taxillus chinensis（DC.）Danser]的干燥帶葉莖枝，具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎元的功能，用于風濕痹痛、腰膝酸軟、筋骨無力、崩漏經多、妊娠漏血、胎動不安、頭暈目眩等[3]。研究發現，桑寄生水提物具有良好的抗炎活性[4]，桑寄生總黃酮對佐劑性關節炎大鼠足趾腫脹程度及全身癥狀具有明顯改善作用，顯現出明顯的祛風濕作用[5]。但桑寄生對骨關節炎軟骨細胞生物行為的影響及其機制目前還少有研究。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類高度保守的內源性非編碼RNA，參與骨關節炎發生發展過程[6]。有研究對膝骨關節炎患者軟骨組織miRNA表達進行檢測，發現miR-375在骨關節炎軟骨組織中高表達[7]，并發現miR-375在病變組軟骨祖細胞中表達上調[8]。miR-375對骨關節炎的影響目前尚不明確?；诖?，本研究體外培養人原代骨性關節軟骨細胞RPOC，觀察桑寄生提取物對白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導的骨關節炎軟骨細胞生長和凋亡的影響，并結合miR-375對其潛在的作用機制進行初步探索。

材料和方法

1 主要試劑

桑寄生購自中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院；IL-1β和MTT購自Sigma-Aldrich；DMEM培養基購自Gibco；RIPA裂解液購自Solarbio；抗細胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、抗P21抗體、抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗caspase-3抗體和抗GAPDH抗體購自Cellular Signaling Technology；辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗購自北京中杉金橋公司；異硫氰酸熒光素標記的膜聯素Ⅴ/碘化丙啶（annexinⅤ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，annexin Ⅴ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；Trizol和Lipofectamine 2000購自Invitrogen；實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）相關檢測試劑盒購自TaKaRa；anti-miR-375、miR-375及各自陰性對照購自GenePharma。

2 方法

2.1 桑寄生提取物的制備 桑寄生提取物的制備參照管俊[9]的方法進行，即桑寄生藥材粉末用70%的乙醇以1∶20的料液比，在80℃條件下提取1.5 h，重復2次。合并2次濾液，濃縮干燥即得桑寄生提取物。

2.2 細胞分離、培養與分組 收集本院因下肢損毀性創傷（無骨關節炎病史）而進行全膝關節置換手術的廢棄組織標本，并經患者或其家屬的知情同意，參照張慶等[10]的方法進行人原代骨性關節軟骨細胞RPOC的分離。對RPOC鑒定后發現，與文獻[10]所述一致，即細胞形態多呈圓形、橢圓形或短梭形，含豐富的胞漿，圓形胞核，核仁1～3個，呈“笑臉狀”，散狀生長，部分細胞融合生長。將分離的RPOC置于含20%胎牛血清的DMEM培養基中培養。將第2代生長狀態良好的RPOC分為對照組（control組，細胞不用IL-1β處理），模型組（IL-1β組，10 μg/L IL-1β處理細胞[11]），SJS低劑量給藥組（IL-1β+SJS-L組，10 μg/L IL-1β和0.09 g/L桑寄生提取物處理細胞），SJS中劑量給藥組（IL-1β+SJS-M組，10 μg/L IL-1β和0.18 g/L桑寄生提取物處理細胞），高劑量給藥組（IL-1β+SJSH組，10 μg/L IL-1β和0.36 g/L桑寄生提取物處理細胞）。

2.3 MTT法檢測細胞活力 將RPOC密度調整為1×107/L，并接種于96孔板，培養24 h、48 h和72 h后加入MTT溶液100 μL，37℃反應4 h，加入二甲基亞砜200 μL，37℃劇烈振蕩培養10 min，于酶標儀檢測RPOC 490 nm下的吸光度（A）值。

2.4 Western blot檢測 cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達 利用RIPA裂解液提取RPOC中總蛋白，進行10%SDS-PAGE，轉膜，室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的抗cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3抗體，4℃孵育過夜。次日，TBST充分洗滌，加入II抗，孵育2 h，化學發光液顯色顯影，以GAPDH作為內參照，分析cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞凋亡的檢測參照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒進行操作。收集RPOC 5×105個，懸浮后依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后室溫避光反應15 min，進行流式細胞儀的檢測。

2.6 qPCR檢測miR-375的表達 利用Trizol試劑提取RPOC總RNA，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，進行qPCR反應。miR-375的正向引物序列為5'-GGCTCTAGAGGGGACGAAGC-3'，反向引物序列為 5'-GGCAAGCTTTTTCCACACCTCAGCCTTG-3'；內參照U6的正向引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。 通 過 2-ΔΔCt法計算miR-375表達。

2.7 細胞轉染實驗 轉染前24 h，將RPOC接種于6孔板。待細胞密度達約70%，利用Lipofectamine 2000試劑在細胞中轉染anti-miR-NC、anti-miR-375、miR-NC和miR-375。其中，轉染anti-miR-NC、antimiR-375的細胞使用10 μg/L IL-1β進行處理，轉染miR-NC、miR-375的細胞使用10 μg/L IL-1β和0.36 g/L桑寄生提取物處理。收集轉染48 h的細胞，按照上述方法檢測細胞活力、凋亡、miR-375、cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表達。

3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，結果表示為均數±標準差（mean±SD）。兩組間數據的比較采用t檢驗，多組數據間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 桑寄生對IL-1β作用的RPOC活力的影響

MTT檢測結果顯示，與control組比較，IL-1β組24 h、48 h和72 h的RPOC活力明顯降低（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-L組在24 h、48 h和72 h的RPOC細胞活力無顯著變化，IL-1β+SJS-M組和IL-1β+SJS-H組在24 h、48 h和72 h的RPOC細胞活力較IL-1β組顯著升高（P＜0.05），見表1。因此選用作用較為明顯的桑寄生提取物濃度0.36 g/L即SJS-H做后續實驗。

Western blot檢測結果發現，與control組比較，IL-1β組RPOC中cyclin D1的表達量明顯減少，P21的表達量顯著增加（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-L組RPOC中cyclin D1和P21蛋白水平無明顯變化，IL-1β+SJS-M組和IL-1β+SJS-H組cyclin D1的表達量顯著增加，P21的蛋白水平明顯降低（P＜0.05），見圖1、表1。

Figure 1.The effect of SJS on the expression of proliferation related-proteins in RPOC treated with IL-1β.圖1 桑寄生對IL-1β作用的RPOC增殖相關蛋白表達的影響

表1 桑寄生對IL-1β作用下的RPOC中cyclin D1和P21蛋白表達及細胞活力的影響Table 1.Effects of SJS on cyclin D1 and p21 protein expression and cell viability of RPOC stimulated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

2 桑寄生對IL-1β作用的RPOC凋亡的影響

流式細胞術檢測結果表明，與control組比較，IL-1β組RPOC的凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC的凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖2A、表2。Western blot檢測結果顯示，與control組比較，IL-1β組RPOC的Bcl-2蛋白表達量明顯減少，Bax和caspase-3蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC的Bcl-2蛋白表達量明顯增加，Bax和caspase-3蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖2B、表2。

Figure 2.The effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β.A：the images of flow cytometry for analyzing the effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β；B：the images of Western blot for determining the effect of SJS on the expression of apoptotic proteins in the RPOC treated with IL-1β.圖2 桑寄生對IL-1β作用的RPOC凋亡的影響

表2 桑寄生對IL-1β作用的RPOC中miR-375表達水平和凋亡的影響Table 2.The effect of SJS on miR-375 expression and apoptosis of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

3 桑寄生對IL-1β作用的RPOC中miR-375表達的影響

qPCR數據顯示，與control組比較，IL-1β組RPOC中miR-375的表達量明顯增加（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC內miR-375的表達量顯著減少（P＜0.05），見表2。

4 抑制miR-375對IL-1β作用的RPOC活力、增殖相關蛋白表達和凋亡的影響

與IL-1β+anti-miR-NC組比較，IL-1β+anti-miR-375組RPOC中miR-375表達量明顯減少（P＜0.05），cyclin D1和Bcl-2蛋白水平顯著升高，而P21、Bax和caspase-3蛋白的水平明顯減少（P＜0.05），24 h、48 h和72 h的細胞活力明顯升高（P＜0.05），并且細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖3及表3～4。

Figure 3.The effect of miR-375 on the apoptosis of the RPOC and the expression of cyclin D1，P21 and apoptosis-related proteins in the RPOC.A：effect of anti-miR-375 on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β；B：effect of anti-miR-375 on the protein levels of cyclin D1，P21 and apoptosis-related proteins in the RPOC treated with IL-1β.圖3 抑制miR-375對IL-1β作用的RPOC凋亡及其中cyclin D1、P21和凋亡相關蛋白表達的影響

表3 抑制miR-375對IL-1β作用的RPOC活力及增殖相關蛋白表達的影響Table 3.The effect of anti-miR-375 on the viability and prroliferation-related protein expression of RPOC treated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

表4 抑制miR-375對IL-1β作用的RPOC凋亡的影響Table 4.Inhibitory effect of anti-miR-375 on the apoptosis of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

5 過表達miR-375能逆轉桑寄生對IL-1β作用的RPOC活力和增殖相關蛋白表達的影響

與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC中miR-375和P21的表達量明顯減少，cyclin D1蛋白水平及24 h、48 h和72 h的細胞活力顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β+SJS-H+miR-NC組比較，IL-1β+SJS-H+miR-375組miR-375和P21的表達量明顯增加，cyclin D1蛋白水平及24 h、48 h和72 h的細胞活力顯著降低（P＜0.05），見圖4、表5。

6 過表達miR-375能逆轉桑寄生對IL-1β作用的RPOC凋亡的作用

與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC中Bax和caspase-3的蛋白水平及凋亡率明顯減少，Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β+SJS-H+miR-NC組比較，IL-1β+SJS-H+miR-375組RPOC中Bax和cas

pase-3的蛋白水平及凋亡率明顯增加，Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖5、表6。

Figure 4.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the expression of cyclin D1 and P21 in the RPOC treated with IL-1β.圖4 過表達miR-375能逆轉桑寄生對IL-1β作用的RPOC中cyclin D1和P21蛋白表達的影響

表5 過表達miR-375能逆轉桑寄生對IL-1β作用的RPOC活力的作用Table 5.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the viability of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

討 論

Figure 5.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the apoptosis of and the protein levels of apoptotic molecules in RPOC stimulated with IL-1β.圖5 過表達miR-375能逆轉桑寄生對IL-1β作用的RPOC凋亡及凋亡蛋白水平的影響

骨關節炎是一種慢性退行性疾病[12]，與年齡、性別和遺傳因素相關的代謝和炎癥因子通過破壞關節軟骨，進而導致骨關節炎。目前已確定多種導致骨關節炎進展的因素，包括參與骨關節炎發病機制的蛋白水解酶和炎性細胞因子[13]。在骨關節炎進展中，促炎細胞因子IL-1β通過刺激軟骨退化和觸發滑膜炎癥發揮關鍵的作用[14]。IL-1β作用于軟骨細胞后，導致軟骨細胞活力的降低和細胞凋亡的增加[15]。本研究采用IL-1β處理人原代骨性關節軟骨細胞RPOC，構建骨關節炎模型，結果發現，與對照組的RPOC比較，IL-1β處理明顯降低24 h、48 h和72 h的細胞活力及cyclin D1、Bcl-2蛋白表達，并提高細胞凋亡率及P21、Bax和caspase-3的蛋白水平，與前人結果相符。本研究還對桑寄生作用于IL-1β處理的RPOC影響上述指標的機制進行了探索。

桑寄生是我國傳統中藥，含有黃酮類、揮發油類、維生素等化學成分，現代藥理研究表明，桑寄生具有抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖和抗氧化等活性[16]。研究表明，桑寄生浸膏對二甲苯刺激的小鼠耳腫脹具有明顯的緩解作用，并加速消退，效果與阿司匹林相當[17]。由桑寄生、熟地等藥材制成的熟地寄生壯骨方具有顯著的抗炎作用，可以有效改善大鼠膝關節腫脹度，并抑制IL-1和IL-6水平[18]。本研究中，IL-1β抑制RPOC增殖并誘導凋亡，而使用桑寄生提取物后，IL-1β作用的軟骨細胞RPOC的活力和凋亡情況與IL-1β組相反，即桑寄生提取物顯著提高細胞活力、cyclin D1、Bcl-2蛋白表達，降低細胞凋亡率、P21、Bax、caspase-3蛋白的水平（P＜0.05），顯示出對IL-1β誘導的軟骨細胞的保護作用。

本實驗的qPCR數據顯示，IL-1β使RPOC中miR-375表達量明顯增加，而加入桑寄生提取物后，miR-375表達量顯著減少，提示桑寄生保護IL-1β刺激的軟骨細胞與可能調控miR-375表達有關。miRNA是一類由22～25個核苷酸組成的非編碼RNA分子，它通過促進降解、抑制翻譯或其它機制，成為基因表達的重要轉錄后調控因子[19]。已有證據表明，miRNA，如miR-34a和miR-181a[20]參與骨關節炎的發生發展過程。miR-375作為一種潛在的腫瘤抑制基因，已被證實在多種人類惡性腫瘤包括乳腺癌[21]、肺腺癌[22]和骨肉瘤[23]中下調。miR-375-3p及其靶點可能作為骨質疏松癥診斷的生物標志物，也可能作為骨質疏松癥治療的新型藥物[24]。但miR-375對骨關節炎的影響尚未明確。本研究發現抑制miR-375顯著減少IL-1β作用的RPOC中miR-375和P21、Bax、caspase-3蛋白的水平及細胞凋亡率，明顯提高cyclin D1、Bcl-2蛋白水平、細胞活力。過表達miR-375能逆轉桑寄生對IL-1β作用的RPOC活力的促進作用和對細胞凋亡的抑制作用，提示桑寄生促進IL-1β誘導的RPOC生長并抑制其凋亡可能與調控miR-375表達有關。

表6 過表達miR-375能逆轉桑寄生對IL-1β作用的RPOC凋亡的作用Table 6.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

總之，桑寄生提取物可以促進IL-1β作用的人原代骨性關節軟骨細胞的活力，并抑制細胞凋亡，其作用機制與調控miR-375表達有關。這一結果為骨關節炎的治療提供了新的線索和潛在的靶點。