RIP1介導的壞死性凋亡通過NF-κB通路調節腎小管上皮細胞炎癥反應*

方曉旭，杜春陽，宋 珊，史永紅，任韞卓，段惠軍

（河北醫科大學病理教研室，河北石家莊050017）

慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）的發生率持續升高，并且嚴重影響患者的生活質量，腎臟持續的炎癥反應與CKD的發生發展密切相關[1]。壞死性凋亡（necroptosis）是細胞程序性死亡的一種新形式[2]，同時具有壞死和凋亡的特征，它是由受體相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）調控的非caspase依賴性的細胞死亡模式，其中，RIP1在壞死性凋亡信號轉導中起到了關鍵作用。在疾病等機體異常狀態下，caspase-8生成顯著增多，啟動了機體的凋亡信號通路。Z-VAD-FMK是一種泛caspase抑制劑[3]，它可以完全抑制RIP1介導的procaspase-8蛋白水解活化，使機體凋亡信號通路被阻斷，進而使凋亡轉化為壞死性凋亡。不同的刺激與壞死性凋亡有關，最具特征的是腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），TNF-α聯合Z-VAD-FMK（T/Z）是誘導壞死性凋亡的經典模型[4-5]。新近研究發現，壞死性凋亡參與了急性胰腺炎[6]、肝炎[7]及克羅恩病[8]的炎癥反應，但在腎小管上皮細胞中，壞死性凋亡與炎癥關系如何，目前尚不清楚。我們在前期研究中發現，壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1（Nec-1）能夠減輕單側輸尿管梗阻小鼠的腎臟炎癥反應[9]，提示壞死性凋亡在腎小管細胞的炎癥反應中具有關鍵調控作用，但具體的調控機制還未明確。吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（ammonium pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC）是一種選擇性核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）抑制劑和抗氧化劑[10-11]，可以抑制許多細胞類型中NF-κB的活化，進而抑制NF-κB通路。本研究在前期實驗基礎上，采用T/Z刺激體外培養的腎小管上皮細胞，構建壞死性凋亡的細胞模型；進一步用Nec-1和PDTC干預細胞，深入探討壞死性凋亡對T/Z刺激的腎小管上皮細胞炎癥反應的調控機制。

材料和方法

1 細胞

人腎小管上皮HK-2細胞購自美國標準生物品收藏中心。低糖型DMEM培養基和DMEM/F12培養基1∶1配制，常規培養。分別給予HK-2細胞TNF-α（50 μg/L）、Z-VAD-FMK（50 μmol/L）、Nec-1（50 μmol/L）和PDTC（20 μmol/L）處理，于24 h后收集細胞觀察，重復細胞實驗5次。

2 主要藥品與試劑

TNF-α購自 PeproTech；Z-VAD-FMK和 Nec-1購自MCE；PDTC購自Abcam；RIP1過表達質粒由Addgene公司惠贈；鼠源抗 RIP1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB激酶（IκB kinase，IKK）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和單核細胞趨化蛋白 1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）多克隆抗體購自Abcam；兔源多克隆抗caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性檢測試劑盒購自Promega；Lipofectamine 3000轉染試劑盒和Opti-MEM培養基購自Thermo Fisher；IL-1β和MCP-1 ELISA試劑盒購自武漢六合生物公司；反轉錄試劑盒購自Promega；Real-time PCR SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa。

3 主要方法

3.1 Western blot檢測蛋白水平 細胞用冰冷的PBS洗2遍，然后加入200 μL預冷的RIPA蛋白裂解緩沖液，冰浴30 min，用細胞刮均勻刮起細胞，收集到1.5 mL的EP管內，4℃、12 000 r/min離心25 min，BCA法測定上清液蛋白濃度。按每孔30 μg細胞裂解蛋白上樣，SDS-PAGE分離，將蛋白轉至PVDF膜上；5%脫脂奶粉37℃孵育1 h封閉PVDF膜，加入抗RIP1（1∶1 000）、caspase-3（1∶800）、IKK-α（1∶5 000）、NF-κB p65（1∶900）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）和MCP-1（1∶1 000）抗體，4℃過夜；室溫孵育1 h，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠或山羊抗兔II抗（1∶5 000稀釋），37℃孵育1.5 h；洗膜后加入Pro-light HRP化學發光試劑，Odyssey Fc成像系統顯影，用UVP LabWorks 4.5分析軟件對Western blot條帶進行定量分析。

3.2 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性檢測 HK-2細胞接種于96孔板，刺激24 h后，收集細胞培養基上清，250×g離心4 min，分別取50 μL上清液于新的96孔板中，在各孔中加入50 μL CytoTox 96室溫避光孵育30min后，再加入50 μL終止液，用酶標儀于490 nm波長處檢測吸光度（A）值，LDH從細胞內的釋放量用細胞壞死百分比表示。

3.3 細胞轉染 構建RIP1過表達質粒，待細胞密度60%～70%進行轉染，準備A、B兩個2 mL的EP管，A管中加入125 μL Opti-MEM培養基和5 μL Lipofectamine 3000 Reagent，B 管 中 加 入 125 μL Opti-MEM培養基、5 μL P3000 Reagent及1 μg RIP1質粒，A、B管混勻，于細胞超凈臺上放置5 min，將混合液加入細胞培養皿中，轉染6 h做后續處理。

3.4 ELISA測定 收集細胞培養基，1 000×g離心25 min，各取50 μL上清于ELISA板中，再在每孔中加入100 μL辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，密封條件下，37℃孵育60 min。棄去孔內液體，用洗滌液重復洗5次，再向每孔中加入50 μL底物A、B，37℃避光孵育15 min。在每孔中加入50 μL終止液，在450 nm波長處測定每孔的A值。

3.5 real-time PCR TRIzol法提取細胞總RNA后按試劑盒步驟反轉錄為cDNA。實時定量PCR采用20 μL反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL。反應條件為：95℃ 30 s；95℃5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環。使用3個復孔的Ct值取平均值，采用公式2-ΔΔCt計算mRNA表達的相對倍數變化。

4 統計學處理

用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 T/Z條件下RIP1介導HK-2細胞壞死性凋亡

Western blot結果顯示，T組HK-2細胞壞死性凋亡相關指標RIP1和凋亡相關指標cleaved caspase-3的蛋白水平均增加，T/Z組RIP1的蛋白水平進一步增加，而cleaved caspase-3的蛋白水平降低（P＜0.01），見圖1A。LDH細胞毒性實驗結果顯示，與control組相比，T組HK-2細胞壞死百分比顯著增加（P＜0.05），T/Z組細胞壞死百分比進一步增加（P＜0.01）；與T/Z組相比，再加入Nec-1干預后（T/Z+N組）細胞壞死百分比顯著下降到（P＜0.01），見圖1B。上述結果提示T/Z可以誘導HK-2細胞發生壞死性凋亡。

Western blot結果顯示，與control組相比，轉染RIP1過表達質粒（RIP1+）組HK-2細胞中RIP1的蛋白表達水平明顯增高，見圖1C。轉染RIP1過表達質粒后，T/Z條件下（T/Z+RIP1+組）的HK-2細胞壞死百分比進一步增加（P＜0.01），見圖1D。上述結果提示RIP1介導了T/Z條件下HK-2細胞的壞死性凋亡。

2 T/Z條件下RIP1介導的壞死性凋亡對HK-2細胞IL-1β和MCP-1蛋白水平的影響

Western blot及ELISA結果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細胞的IL-1β和MCP-1蛋白水平增高；與T/Z組相比，Nec-1干預下調IL-1β和MCP-1的蛋白水平；反之，轉染RIP1過表達質粒明顯上調IL-1β和MCP-1的蛋白水平（P＜0.01），見圖2。

3 T/Z條件下RIP1介導的壞死性凋亡對HK-2細胞NF-κB通路的影響

Western blot結果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細胞中NF-κB通路相關蛋白IKK-α和NF-κB p65的水平增高，同時p-NF-κB p65蛋白水平也增高，再給予Nec-1干預則上述蛋白水平降低（P＜0.01）；與T/Z組相比，轉染RIP1過表達質?？擅黠@上調HK-2細胞中上述蛋白的水平（P＜0.01），見圖3A。real-time PCR結果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細胞中NF-κB的mRNA表達水平增高，再給予Nec-1干預則NF-κB的mRNA表達水平下降（P＜0.01）；與T/Z組相比，轉染RIP1過表達質?？擅黠@上調HK-2細胞中NF-κB的 mRNA表達水平（P＜0.01），見圖3B。這提示在T/Z條件下，RIP1介導的HK-2細胞壞死性凋亡激活了NF-κB通路。

4 T/Z條件下NF-κB通路參與RIP1介導的HK-2細胞炎癥

Western blot結果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細胞中 NF-κB 通路相關蛋白 IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65及下游分子IL-1β和MCP-1的水平增高，再給予PDTC干預后（T/Z+P組），上述蛋白水平降低（P＜0.01）；PDTC和Nec-1聯合干預HK-2細胞后（T/Z+P/N組），上述蛋白水平降低更明顯（P＜0.01），見圖4。這提示在T/Z條件下，NF-κB通路可能參與RIP1介導的HK-2細胞炎癥。

討 論

Figure 1.RIP1 mediated necroptosis of HK-2 cells under T/Z condition.A：Western blot was used to determine the protein levels of RIP1 and caspase-3；B：the release rate of LDH under T/Z and T/Z+N conditions；C：Western blot analysis of transfection of RIP1 over-expression plasmid in the HK-2 cells；D：the release rate of LDH in T/Z-treated cells with or without RIP1 over-expression.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs T group；&&P＜0.01 vs T/Z group.圖1 T/Z條件下RIP1介導HK-2細胞壞死性凋亡

Figure 2.The relationship between RIP1-mediated necroptosis of HK-2 cells and inflammation under T/Z condition.A：the levels of IL-1β and MCP-1 in the supernatant were measured by ELISA；B：Western blot results showed IL-1β and MCP-1 levels in cells.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs T/Z group.圖2 T/Z條件下RIP1介導的HK-2細胞壞死性凋亡和炎癥的關系

Figure 3.The relationship between RIP1-mediated necroptosis of HK-2 cells and NF-κB pathway under T/Z conditions.A：NF-κB pathway-related proteins were determined by Western blot；B：the mRNA expression of NF-κB was detected by real-time PCR.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs T/Z group.圖3 T/Z條件下RIP1介導的HK-2細胞壞死性凋亡和NF-κB通路的關系

Figure 4.NF-κB pathway was involved in RIP1-mediated HK-2 cell inflammation under T/Z condition.The protein levels of NF-κB pathway-related molecules in the HK-2 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；&&P＜0.01 vs T/Z group；++P＜0.01 vs T/Z+P group.圖4 T/Z條件下NF-κB通路參與RIP1介導的HK-2細胞炎癥

壞死性凋亡是一種受調節的細胞死亡類型，其與壞死具有相似的形態學特征（早期包膜完整性破壞，細胞體積及胞內細胞器腫脹）[2]，而壞死是一種被動的，不受管制的細胞死亡形式。在質膜透化后，一般FasL/TNF通過激活Fas/TNFR1死亡結構域，相繼形成RIP1的TNFR復合體Ⅰ和TNFR復合體Ⅱ，繼而活化caspase級聯反應而啟動常規的細胞凋亡。但在此途徑中TNFR復合體Ⅱ中的RIP1會與RIP3緊密結合并相互磷酸化，活化的RIP3進一步導致其底物混合譜系激酶結構域樣蛋白磷酸化[12]，觸發細胞通透化和細胞破壞，繼而啟動壞死性凋亡。T/Z是經典的壞死性凋亡模型[4-5]。Z-VAD-FMK是一個泛caspase抑制劑，TNF-α誘導的procaspase-8蛋白水解活化被Z-VAD-FMK完全抑制，使得RIP1的裂解減少，進而使細胞發生壞死性凋亡。LDH是一種極為穩定的細胞質酶，存在于正常細胞的胞質中，正常時不能通過細胞膜，當細胞受損或死亡時可釋放到細胞外，所以細胞死亡數目與細胞培養上清中的LDH活性成正比。本研究發現單獨給予HK-2細胞TNF-α刺激，可以同時發生壞死性凋亡和凋亡，TNF-α和Z-VAD-FMK聯合刺激HK-2細胞，凋亡途徑受到抑制，壞死性凋亡途徑被激活；進一步轉染RIP1過表達質粒，T/Z+RIP1+組與T/Z組相比HK-2細胞壞死百分比顯著升高，提示T/Z條件下RIP1介導了HK-2細胞壞死性凋亡。

壞死性凋亡參與多種疾病炎癥的發生，如心力衰竭[13]、克羅恩病[8]、肝炎[7]、急性胰腺炎[6]、急性腎損傷[14]、順鉑治療小鼠的腎功能障礙[15]及糖尿病心肌病[16]等。本研究發現TNF-α和Z-VAD-FMK聯合刺激HK-2細胞后IL-1β和MCP-1的表達水平均有明顯提高，提示在T/Z條件下，RIP1介導的HK-2細胞壞死性凋亡的發生與炎癥有關，但壞死性凋亡調節炎癥的機制報道尚少。

Nec-1是一種有效的RIP1抑制劑[17-18]，能夠抑制RIP1的活化，并隨后阻斷壞死體的形成，最終阻斷壞死性凋亡。本研究發現給予T/Z組HK-2細胞Nec-1干預后細胞壞死百分比顯著減少，NF-κB的mRNA表達水平下降，NF-κB通路相關蛋白IKK-α、NF-κB p65和p-NF-κB p65的蛋白水平也明顯降低，提示在T/Z條件下，RIP1介導的HK-2細胞壞死性凋亡激活了NF-κB通路。

PDTC是NF-κB的特異性抑制劑[10-11]，可通過抑制NF-κB p65亞單位或IκB的降解來抑制NF-κB的激活。我們進一步給予T/Z組HK-2細胞PDTC干預，NF-κB 通路相關蛋白 IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-1β和 MCP-1的蛋白水平降低，Nec-1和PDTC聯合干預HK-2細胞，對上述指標的抑制程度更顯著。這提示在T/Z條件下，NF-κB通路可能參與RIP1介導的HK-2細胞炎癥。

綜上所述，RIP1介導的壞死性凋亡可以誘導腎小管上皮細胞發生炎癥反應；NF-κB通路可能參與這一過程，抑制NF-κB通路可以減輕RIP1介導的壞死性凋亡引發的腎小管炎癥反應。這些結果可為慢性腎臟疾病的治療提供新的思路。