利用體外發酵模型研究葉綠素對兒童腸道菌群的影響

李媛媛 歐雅文 崔 羽 張 燕

（中國農業大學食品科學與營養工程學院 國家果蔬加工工程技術研究中心 北京100083）

隨著生活水平的提高，居民高脂肪、高蛋白飲食的攝入使肥胖、 高血脂等代謝疾病的發病率在全世界普遍上升[1]。 為了降低肥胖發生率，緩解這一健康問題，2016年美國農業部和中國營養學會分別修訂了各自的膳食指南， 指南中均明確提出增加蔬菜的攝入量[2-3]。 葉綠素作為綠色蔬菜中含量最為豐富的色素，其決定了果蔬的品質特征，國內外研究發現其還具有降低膽固醇， 調節腸道功能，抗突變等生理功能[3]。近年來，隨著深色蔬菜中花色苷、多酚等非營養物質研究的深入，攝入蔬菜后葉綠素的生物活性和營養價值引起研究人員的重視， 目前人們對葉綠素的生物活性作用的了解還十分有限[4]。

人體腸道中含有大量的與宿主共存的微生物，這些菌群共同構成了人體獨特的腸道環境，個體的腸道菌群種類和豐度都不同[5]。 近年來，腸道菌群及其代謝產物對宿主的健康作用受到研究者們極大的關注。 大量研究表明胎兒出生時腸道沒有細菌定植，出生7～10 d 開始需氧菌或兼性厭氧菌的先期定植和繁殖， 從此經歷了腸道菌群從無到有，從簡單到復雜的過程，出生至2 歲嬰兒期是腸道菌群形成并達到平衡的最重要時期， 此期的菌群決定了機體日后免疫應答和代謝等[6]。前期研究發現， 葉綠素對乳酸鏈球菌的生長特性及代謝水平均有顯著影響， 而乳酸菌作為人體腸道中的有益菌，在人體腸道中能發揮營養功能作用[9]。 嬰兒剛出生后， 最初腸道菌群中以乳酸菌屬為優勢菌，隨著嬰兒的成長，腸道菌群中乳酸菌屬數量反而下降[4]，這一結果值得深入研究。

基于此，本試驗以葉綠素為對象，研究其對不同年齡兒童（2 歲和5 歲）腸道菌群的影響，探究葉綠素是否會影響兒童腸道菌群中乳酸菌屬的豐度等， 幫助人們了解葉綠素的早期攝入與健康的關系， 從營養角度為綠色蔬菜的攝入提供合理的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

新鮮菠菜（Spinacia oleracea L.），中國農業大學家屬區農貿市場；2 歲健康兒童1 名（重復取糞便樣本5 次）；5 歲健康兒童1 名 （重復取糞便樣本5 次）；色譜級甲醇、三氯甲烷、乙腈、正己烷，美國Thermo fisher 公司； 濃硫酸、95%無水乙醇、厭氧肉湯培養基、L-半胱氨酸鹽酸鹽、刃天青等均為分析純試劑，試驗中所用的水均為超純水。

1.2 試驗設備與儀器

CR21GⅢ型高速冷凍離心機，日本日立公司；DHP-9082 恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司；JYDZ-31B 九陽打漿機， 九陽股份有限公司；Acquit UPLC 液相色譜儀 （UPLC）， 美國Agilent 公司；T6 新世紀旋轉蒸發儀， 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葉綠素制備 參照Rivera-Chávez 等[7]的方法提取新鮮菠菜中的葉綠素。 將洗凈晾干的菠菜葉去梗，放攪拌機中，并倒入適量乙醇（料液比1∶3），攪拌成漿。4 ℃，8 000 r/min 離心6 min，所得上清液在36 ℃水浴條件下旋轉真空蒸發濃縮，獲得葉綠素濃漿，隨后測定葉綠素濃度。用移液槍吸取1 mL 葉綠素濃縮液， 梯度稀釋100 倍后分別在645，663 nm 處測吸光度值OD， 以體積分數80%的丙酮為對照。 葉綠素水平計算公式如下：

Ca=12.71A663-2.59A645

Cb=22.88A645-4.67A663

C=Ca+Cb=8.04A663+20.29A645

本試驗中， 得到葉綠素溶液平均質量濃度為7 mg/mL。

1.3.2 體外糞便發酵實驗 參照Parkar 等[8]的方法，對采集到的受試者的糞便樣本發酵24 h，體外模擬腸道菌群的變化。試驗前，將所有緩沖液置于N2環境下24 h。向pH 6.8 的厭氧肉湯培養基中添加0.05%過濾消毒的L-半胱氨酸鹽酸鹽和0.00005%的刃天青的發酵培養液分裝于厭氧瓶中，充氮密封，滅菌。 而后向厭氧培養管中用注射器分別加入葉綠素樣品10 mL 以及10%糞便懸液10 mL，混合振蕩，厭氧環境37 ℃搖床（70 r/min）總計培養24 h， 取發酵液時間點設定為0，4，8，12，16，20，24 h。

1.3.3 腸道菌群豐度及多樣性測定 分別取不同處理的糞便樣本， 采用MoBio 公司PowerSoil-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit 試劑盒對樣本的基因組DNA 進行提取， 具體步驟按說明書操作，所提取的DNA 于-20 ℃保存備用。 使用Promega公司的GoTaqRHot Start Colorless Master Mix 進行PCR 擴增， 引物為16S V4 區特異引物515 F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）-806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）， 產物使用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，Qiagen公司的QIAquickRPCR Purification Kit 試劑盒純化回收產物， 并使用Pico Green 熒光定量以及Agilent 2200 TapeStation 電泳工作平臺檢測，合格后使用Illumina 公司的Miseq 設備測序進行上機測序及菌群數據相關分析。

1.3.4 短鏈脂肪酸及有機酸HPLC 法測定 采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）測定有機酸、短鏈脂肪酸等乳酸菌代謝產物的變化趨勢[9]。 具體試驗方法如下：分別配制乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸、乳酸等標準品的系列濃度梯度， 用0.22 μm 的水相濾膜進行過濾，濾液用高效液相色譜法測定，定量分析后繪制標準曲線， 用于后續有機酸和短鏈脂肪酸含量的計算。 HPLC 條件為：用超純水作為流動相A， 在13 mm 水系濾膜下過濾后的0.005 mol/L H2SO4作為流動相B， 等梯度洗脫， 流速0.5 mL/min，柱溫65 ℃，進樣量10 μL，檢測波長210 nm。

1.3.5 數據統計與分析 每個試驗重復至少3次，數據統計分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul, MN）軟件包中Linear Models 程序進行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD 程序，采用Origin 8.1（Microcal Software，Inc.，Northampton USA）制圖軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 葉綠素對腸道菌群多樣性的影響

菌群多樣性分析采用香農指數，指數值越大，代表群落多樣性程度越高。Clarke 等[10]研究表明菌群多樣性的減少與健康問題相關， 將各組間及各個樣本的多樣性指數進行比較，如圖1 所示。 圖1（A-24 h）中，分析2 歲兒童腸道菌群多樣性的變化發現，添加葉綠素使菌群多樣性顯著降低，發酵24 h 多樣性指數由2.6～3.2 降至2.4～2.7， 平均多樣性降低14%。 同樣在圖1（B-24 h）中顯示，5 歲兒童糞便發酵24 h 后，添加葉綠素也使菌群多樣性由2.5～2.8 降至1.8～2.4，平均多樣性降低19%?？梢?， 葉綠素顯著降低腸道菌群多樣性。 Sommer等[11]研究發現菌群多樣性會影響宿主的健康發展，多樣性越高可能會產生更多的積極作用。但本試驗中對前20 個優勢菌屬進行分析，發現降低的菌屬主要包括擬桿菌屬（Bacteroides）、 雙岐菌屬（Bifidobacterium）、 未分類的腸桿菌（Unclassified Bacillales）、 未分類的瘤胃科菌屬（Unclassified Ruminococcaceae）、霍亂弧菌（Dialister），除擬桿菌屬（Bacteroides）、雙岐菌屬（Bifidobacterium）外，其它有所下降的菌屬均對人體有不利的影響， 因此本試驗結果中， 葉綠素降低了兒童腸道菌群多樣性是否對兒童健康有影響，仍需要進一步研究。

圖1 香農指數（Shannon index）變化Fig.1 Changes of Shannon index

2.2 葉綠素對腸道菌群相對豐度的影響

2.2.1 群落組成分析 腸道菌群門和屬的平均值如圖2 所示， 通過對測序樣品的序列進行比對分析，人體腸道菌群序列主要分屬于4 個菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形桿菌門 （Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。 剩余的序列分別包括黏膠球形菌門（Lentisphaerae）、梭桿菌門（Fusobacteria）、螺旋菌門（Spirochaetae）、軟壁菌門（Tenericutes）和疣微桿菌門（Verrucomicrobia）， 另外還包括未分類的細菌。

在屬（genus）的水平上，可以看出，人體腸道中含量較多的菌屬包括變形菌門中的埃希氏-志賀菌屬（Escherichia_Shigella）、 普雷沃菌屬（Prevotella）、小類桿菌（Dialister）、腸球菌屬（Enterococcus）、 腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriaceae），擬桿菌門中的擬桿菌屬（Bacteroides），放線菌門中的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、柯林斯菌（Collinsella）。 下面對有差異的菌屬進行分析。

2.2.2 屬水平的差異分析 雙歧桿菌屬相對豐度變化如圖3a 所示，2 歲兒童樣本中，添加葉綠素顯著降低了雙歧桿菌屬的豐度（P<0.05），發酵12 h時，由4.7%下降至2.8%，約下降39%。 與2 歲兒童樣本不同，5 歲兒童樣本中雙歧桿菌屬豐度無顯著性差異 （P>0.05）， 發酵12 h 時微量上升。Huang 等[13]研究發現雙歧桿菌屬具有較高的營養功能，如快速降解乳糖、產生乳酸和短鏈脂肪酸、輔助消化吸收、 通過菌膜屏障及產生雙歧桿菌素抑制多種致病菌等， 在母乳喂養的0～1 歲兒童腸道內豐度較高。 在本試驗中推測兩歲兒童樣本中雙歧桿菌屬豐度的降低可能與樣本年齡及腸道菌群穩定性相關， 因為2 歲兒童的腸道菌群結構此時為飲食方式影響階段， 葉綠素的攝入可能對2歲兒童菌屬的影響較大[6]。 此外，Krautkramer 等[12]研究發現雙歧桿菌屬作為人體腸道內的益生菌，在人體腸道定植較難，且受環境、飲食等因素影響較大，因此，葉綠素的攝入可能造成2 歲兒童雙歧桿菌屬豐度的降低， 而5 歲兒童此時的腸道菌群已經趨于穩定， 因此葉綠素攝入對5 歲兒童腸道菌群中的雙歧桿菌屬豐度影響較小。 值得注意的是雙歧桿菌屬豐度的降低是否對2 歲兒童的健康產生影響，目前尚不可知，進一步的研究仍需進行。

圖2 腸道菌群門和屬的平均值Fig.2 The average value of phylum and genus of gut microbiota

柯林斯菌是放線菌門中的主導菌， 其相對豐度變化如圖3b 所示，葉綠素使兒童腸道菌群中柯林斯菌屬的相對豐度顯著下降（P<0.05）， 其中2歲兒童12 h 樣本中柯林斯菌屬相對豐度由3.1%下降至1.9%， 下降率約36%；5 歲兒童12 h 樣本中柯林斯菌屬相對豐度由1.7%下降至0.4%，下降率約68%。 Rosenbaum 等[14]研究發現柯林斯菌屬的豐度與促炎細胞因子IL-17A 水平呈正相關，柯林斯菌屬的相對豐度越高，促炎因子IL-17A 分泌水平越高。 IL-17A 能通過誘導Th17 細胞產生分泌型抗體IgA， 進而對免疫系統起調節作用。 Liu等[15]研究發現在動脈粥樣硬化病人糞便菌群中柯林斯菌屬數量會上升， 且與高密度脂蛋白水平呈負相關，而類風濕性關節炎病人、潰瘍性結腸炎病人腸道中柯林斯菌屬豐度也發生改變， 因此結合本試驗結果推測葉綠素可能通過降低柯林斯菌屬的相對豐度實現對人體的健康作用。

葉綠素對乳酸菌屬豐度的影響如圖3c 所示。發酵12 h 時兒童樣本腸道菌群中乳酸菌屬豐度均有所上升， 其中2 歲兒童糞便中乳酸菌屬的豐度增加更顯著（P<0.05），這與實驗室前期研究葉綠素對乳酸鏈球菌生長特性及代謝產物的影響結果一致，和對照組相比，葉綠素顯著增加乳酸鏈球菌代謝產物水平， 證明了葉綠素具有一定的生物活性作用。 Terayama 等[16]研究發現乳酸菌屬在宿主腸道中屬于有益菌，對宿主有解毒、降血脂抗癌等多種健康作用。 此外，張海均等[17]研究發現大鼠在飲用亞硝酸鹽含量較高的泡菜水時， 同時攝入石榴皮中的多酚提取物， 發現多酚提取物能通過提高大鼠腸道菌群中乳酸菌數量， 促進亞硝酸鹽的降解達到解毒目的。因此，本試驗結果顯示葉綠素可能與多酚類非營養物質一樣， 能促進乳酸菌屬豐度的上升，促進對宿主的解毒作用。

圖3 兒童腸道中雙歧桿菌屬、柯林斯菌屬、乳酸菌屬相對豐度 （12 h）Fig.3 The relative abundance of Bifidobacterium， Collinsella， Lactobaillus in children’s gut （12 hours）

2.3 葉綠素對腸道菌群代謝物的影響

圖4～圖6 為發酵24 h 時葉綠素對兒童腸道菌群代謝物水平的影響，主要探討乳酸、乙酸、丙酸的變化趨勢。 如圖4 所示，添加葉綠素促進了5歲兒童腸道菌群代謝物乳酸水平顯著上升（P<0.05），由發酵24 h 的42 μg/mL 升至101 μg/mL，2歲兒童樣本中乳酸水平同5 歲兒童樣本呈現相同的變化趨勢。 Fung 等[18]綜述了腸道中的乳酸能給腸道環境提供穩定的酸性環境， 抑制丙酮酸轉化為乳酸， 促進丙酮酸參與三羧酸循環， 進行糖酵解，促進宿主的身體代謝。因此結合上述乳酸菌屬變化趨勢可推測本研究中葉綠素可能通過促進腸道中乳酸菌數量的生長， 促進不同年齡兒童腸道菌群代謝物乳酸水平上升。

發酵24 h 葉綠素對腸道菌群產乙酸水平的影響如圖5 所示。 由圖5 可知添加葉綠素促進5歲兒童腸道菌群代謝物乙酸水平顯著上升， 發酵24 h 由0.23 μg/mL 升至0.3 μg/mL（P<0.05），同樣的， 添加葉綠素也顯著促進2 歲兒童樣本中乙酸水平的上升（P<0.05）。

發酵24 h 葉綠素對腸道菌群產丙酸水平的影響如圖6 所示。添加葉綠素后發酵24 h 時，5 歲兒童腸道菌群代謝物丙酸水平由0.34 μg/mL 上升至0.39 μg/mL（P<0.05），而2 歲兒童樣本中丙酸水平微量下降，可能由于2 歲兒童年齡較小，且個體的腸道菌群差異較大， 因此代謝物種類和水平均有差異。兒童腸道菌群代謝物乙酸、丙酸水平的上升可能是由于葉綠素促進產乙酸、 丙酸相關的菌群的生長，或促進菌群對乙酸、丙酸的分泌，但仍需進一步試驗證明葉綠素與菌群的關系。 Fung等[18]研究發現短鏈脂肪酸微量的增加也會對人體產生積極的健康作用， 如丁酸鹽在mmoL 濃度下就能發揮抑制腫瘤細胞增值、分化，并誘導細胞凋亡的作用。 Voltolini 等[19]研究發現乙酸、丙酸均能促進宿主的健康發展， 包括保護宿主腸道上皮細胞完整性，提供能量以及抗癌作用。 因此，本試驗結果發現葉綠素能促進乙酸、 丙酸水平的微量上升， 是進一步理解葉綠素生物活性實現的可能途徑。

圖4 乳酸水平的變化Fig.4 Change of lactic acid

圖5 乙酸水平的變化Fig.5 Change of acetic acid

圖6 丙酸水平的變化Fig.6 Change of propionic acid

3 結論

本研究通過體外分別對不同年齡段兒童糞便進行體外發酵試驗， 對腸道菌群進行16S rDNA測序，對菌群豐度和多樣性進行分析，同時測定菌群代謝物水平變化， 探究葉綠素對腸道菌群的影響，結論如下：葉綠素的添加降低了兒童腸道菌群多樣性， 由于兒童樣本在年齡、 個體方面存在差異，葉綠素對其作用效果也存在差異。兒童糞便中微生物以放線菌門、變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為主。屬水平上添加葉綠素促進柯林斯菌、雙岐菌屬相對豐度的下降，乳酸菌屬相對豐度上升；且比較5 歲兒童樣本，在2 歲兒童樣本中，食源性物質的攝入對雙岐菌屬、 乳酸菌屬這類人體腸道不易定植的菌屬影響較大，此外，攝入葉綠素有助于增加不同年齡兒童腸道菌群代謝物乳酸、 乙酸的水平。