紅毛藻多糖的化學組成及其體外免疫誘導活性研究

余 剛 蔡 薇 宋田源 姜澤東，3* 倪 輝，3 劉光明，4

（1 集美大學食品與生物工程學院 福建廈門361021 2 廈門市疾病預防控制中心 福建廈門361021 3 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室 福建廈門361021 4 廈門市海洋功能食品重點實驗室 福建廈門361021）

海藻多糖具有多種優良的生物活性， 如免疫調節、降血脂、降血壓、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抑菌活性等[1-8]，特別是其免疫調節活性，在功能食品和醫藥品領域有重要的開發和應用價值。 目前已有多種海藻多糖被發現具有強效的免疫調節活性，如巖藻聚糖、泡葉藻聚糖、紫菜多糖、龍須菜多糖等[3，9-10]。 隨著對海藻多糖活性研究的深入， 海藻多糖的作用機理和功效關系已成為多糖領域的研究熱點之一。

紅毛藻（Bangia fusco-purpure）是我國東南沿海特有的經濟紅藻資源，又稱紅毛菜、紅棉藻等，屬紅藻門，原紅藻綱，紅毛菜目，紅毛菜科，紅毛菜屬，在福建沿海分布較廣，莆田市南日島鎮是其主要產地之一。相關研究和民間應用實踐表明，紅毛藻具有提高免疫力、降血壓、降血脂、滋陰祛火和防止動脈粥狀硬化等心血管疾病的食、藥用功效，而對其作用機理尚不明確。 多糖是紅毛藻藻體的主要結構物質之一， 同時也是主要的生物活性成分之一，目前關于紅毛藻多糖的結構、生物活性及活性機理鮮有報道[11-13]。

通過熱水抽提和乙醇沉淀的方法提取紅毛藻粗多糖[14]，用陽離子交換柱層析和葡聚糖凝膠過濾柱層析對粗多糖進行初步純化， 獲得紅毛藻多糖BFP。 Jiang 等[15]研究表明BFP 是一種硫酸化多糖，主要由半乳糖、糖醛酸和硫酸基團組成；本研究采用DEAE-cellulose52 陰離子交換柱層析的方法分級制備紅毛藻多糖3 個組分F1、F2 和F3，對其進行單糖組成及化學組成分析， 明確其多糖的基本組成特征。 利用小鼠巨噬細胞RAW264.7 模型，圍繞紅毛藻多糖BFP 及其分級純化多糖組分F1、F2、F3 的誘導RAW264.7 細胞活化釋放免疫因子，包括一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）的活性（體外免疫誘導活性檢測指標）展開研究[16-17]，旨在明確其免疫調節活性和相關機理， 闡明紅毛藻具有提高免疫力功效的作用機制， 為紅毛藻及其多糖組分在食品和醫藥領域的開發和應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

紅毛藻藻體，采集于福建省莆田市南日島海域。

小鼠巨噬細胞系RAW264.7， 購自中科院上海細胞庫。

胎牛血清（FBS），中國賽默飛世爾科技公司；100X 青鏈雙抗溶液， 美國sigma 公司； 高 糖DMEM培養基， 美 國Hyclone 公 司；噻唑藍（MTT），美國sigma 公司；四唑氮藍（NBT），美國sigma 公 司；Mouse TNF-α Colorimetric ELISA kit， 美 國Thermo Fisher Scientific 公司；DEAEcellulose 52 填料， 美國Whatman 公司；Sephadex G-75 葡聚糖凝膠層析柱和Superdex 75 10/300 GL 凝膠層析柱， 瑞典GE 公司； 牛血清蛋白（BSA），美國Sigma 公司；標準單糖和內標：D-阿拉伯糖（Ara）、D-半乳糖（Gal）、L-木糖（Xyl）、L-巖藻糖（Fuc）、D-甘露糖（Man）、D-葡萄糖（Glc），美國Sigma 公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）， 阿拉丁試劑 （上海）有限公司； 抑制劑SB203580，SP600125，U0126，美國Sigma 公司；抑制劑PDTC，碧云天生物技術研究所；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器和設備

Avanti J26XP 高速冷凍離心機， 德國貝克曼公司；Free Zone 6 plus 真空冷凍干燥機， 美國Labconco 公司；BioTek Cytation-5 細胞成像多功能檢測系統，美國伯騰儀器有限公司；1360 Infinity 超高壓高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器和Inert SustainRC18 色譜柱）， 中國安捷倫科技有限公司；iS50 FT-IR 紅外光譜儀，中國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅毛藻多糖的提取及純化 預處理： 紅毛藻藻體洗凈，烘干，經粉碎后過100 目篩網得到藻粉。 準確稱取50 g 干燥藻粉，加入300 mL 甲醇，攪拌后浸泡過夜以除去醇溶性色素和雜質， 反復抽提3 次后，烘干備用。

多糖提取[18]：稱取50 g 上述預處理后的干燥藻粉加入1 L 超純水，置于電熱磁力攪拌器上，攪拌轉速200 r/min，于95 ℃進行熱水抽提2 h，離心（4 000 g，20 min），收集上清液，殘渣中再加入1 L超純水，繼續提取2 h，離心，合并2 次提取的上清液， 減壓蒸發濃縮至300～400 mL。 用體積分數75%乙醇沉淀粗多糖，4 ℃靜置過夜后， 離心（8 000 g，20 min），收集沉淀。收集的沉淀用少量超純水復溶，置于3 500 u 分子質量截留的透析袋中，超純水透析48 h。收集透析袋中溶液并冷凍干燥以獲得紅毛藻粗多糖。

多糖純化：采用Sevage 法[14]除去粗多糖中的蛋白質， 去除蛋白質后多糖采用上述體積分數75%乙醇沉淀法回收，經透析、冷凍干燥后備用。將去除蛋白質的多糖配制成多糖溶液（5 mg/mL），上Dowex 50W×8 陽離子交換柱層析（26 mm I.D.× 200 mm），用超純水進行洗脫，并采用苯酚-硫酸法[19]在490 nm 下的吸光值（OD490）來檢測洗脫液中多糖含量，收集含有多糖的洗脫液，調節pH至7.0，經48 h 超純水透析、冷凍干燥后備用。 將經陽離子交換柱層析后的多糖用0.1 mol/L NaCl制成5 mg/mL 多糖溶液，經0.22 m 的濾膜過濾后，上Sephadex G75 凝膠過濾柱層析（16 mm I.D.×1 000 mm），用0.1 mol/L NaCl 溶液進行洗脫，控制流速為0.2 mL/min， 利用色譜樣品自動收集器連續收集40 管，每管5 mL，并采用苯酚-硫酸法在490 nm 下的吸光值（OD490）來檢測每管多糖含量，以洗脫體積為橫坐標，OD490為縱坐標作圖， 繪制洗脫曲線。 收集處于洗脫峰處管中的洗脫液，經48 h 超純水透析、 冷凍干燥后， 獲得紅毛藻多糖（B. fusco-purpure polysaccharide，BFP）。

1.3.2 紅毛藻多糖的分級分離 將BFP 溶于超純水制成5 mg/mL 的多糖溶液， 經0.22 μm 的濾膜過濾后， 取3 mL 上樣于DEAE-cellulose 52 離子交換色譜柱（26 mm I.D. × 200 mm），分別選取不同濃度（0，0.1，0.3，0.5 和1.0 mol/L）的NaCl 溶液對BFP 進行梯度洗脫。 按每管10 mL 進行收集， 采用苯酚-硫酸法檢測每管中多糖的含量，于490 nm 處測定吸光值（OD490）。 以OD490對洗脫體積作圖，繪制曲線。 經多次重復后，收集相同出峰位置的多糖組分，超純水透析48 h 后，冷凍干燥，獲得紅毛藻多糖組分。

1.3.3 多糖的化學組成分析 采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品，測定總糖含量；采用BCA法[20]，以BSA 為標準品，測定蛋白質含量；采用氯化鋇明膠比濁法[21]，以K2SO4為標準樣品，測定硫酸根含量；采用咔唑-硫酸法[22]，以葡萄糖醛酸為標準品，測定糖醛酸含量；采用Folin-酚試劑法[23]，以沒食子酸作為標準品，定量檢測多酚的含量。

1.3.4 多糖平均分子質量的測定 使用凝膠色譜法[24]測定BFP 及各多糖組分的平均分子質量。 將100 μL 的多糖樣品溶液（5 mg/mL），用0.22 μm 濾膜過濾除雜后，上樣于制備型液相色譜儀（AKTApurify）， 檢測柱為Superdex 75 10/300 GL （10 mm I.D. × 400 mm）。 在室溫條件下用0.1 mol/L的NaCl 溶液進行洗脫， 洗脫流速為0.5 mL/min。利用苯酚-硫酸法檢測收集的洗脫液中多糖的含量， 根據洗脫體積和各管吸光度值繪制出洗脫曲線。 以分子質量為5，12，25 和50 ku 的葡聚糖作為標準品， 多糖樣品用上述同樣方法并結合分子質量標準曲線計算多糖的平均分子質量。

1.3.5 紅毛藻多糖的單糖組成分析 多糖的水解：取4 mg 的多糖，加入2 mL 2 mol/L 的三氟乙酸，密封，100 ℃水解3 h，60 ℃烘干除去三氟乙酸溶液， 殘余物中加入4 mL 正丁醇， 渦旋振蕩2 min，60 ℃烘干后再加入正丁醇，混勻烘干，如此反復2～3 次，以徹底除凈三氟乙酸，殘余物用1 mL的蒸餾水溶解，4 ℃保存備用。

單糖組成分析：采用柱前PMP 衍生法[25-26]衍生單糖標準品和多糖的水解產物。 配制一定濃度的Man，Xyl，Glc，Gal，Ara 和Fuc 的單糖標準溶液和混合標準溶液。 各標準溶液分別取50 μL 置于具塞試管中， 各加50 μL 0.6 mol/L 的NaOH 溶液，漩渦混勻；再加100 μL 0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液， 漩渦混勻后置于70 ℃的烘箱中避光反應100 min，取出避光放置，冷卻至室溫，加50 μL 0.3 mol/L 的HCl 溶液， 用超純水補充至2 mL，再加2 mL 的三氯甲烷，漩渦混勻，靜置，棄去三氯甲烷相后重新加2 mL 三氯甲烷，如此萃取3 次。 將水相用0.22 μm 微孔膜過濾后， 用HPLC 進行分析。 多糖水解樣品以上述同樣的方法進行處理并分析。

1.3.6 紅毛藻多糖的紅外分析 將多糖樣品烘干至恒重后，與KBr 粉末充分混合、研磨均勻，壓片后使用is50 FT-IR 紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內掃描，記錄多糖樣品的譜圖。

1.3.7 細胞培養 小鼠巨噬細胞系RAW264.7 采用含10% FBS、100 U/mL 青霉素及100 μg/mL 鏈霉素的高糖DMEM 培養基， 于37 ℃、5% CO2的CO2細胞培養箱中培養。 在試驗過程中對培養細胞進行分組，如下：

陰性對照組（Control）：不含LPS 和多糖；陽性對照組：以2 ng/mL 的LPS 處理；樣品組（Sample）：不同質量濃度（0～100 μg/mL）的BFP，各組分（F1、F2、F3）溶液；空白組（Blank）：DMEM 生長培養基。

1.3.8 細胞活力分析 通過MTT 法[27]來測定多糖樣品對RAW264.7 細胞活力的影響。 將處于對數生長時期的RAW264.7 細胞以3×104細胞/孔的濃度接種于96 孔細胞培養板， 于37 ℃、5% CO2的CO2培養箱中孵育24 h 后， 用不同質量濃度的各多糖樣品溶液（0～100 μg/mL）孵育24 h，除去上清后，每孔加入終質量分數為5%的MTT 溶液，繼續孵育30 min，移去上清后，加入100 μL DMSO，振蕩20 min， 于細胞成像多功能檢測系統測量570 nm 處吸光值（OD570）。采用以下公式計算計算細胞活力。

1.3.9 多糖誘導RAW264.7 細胞活化釋放免疫因子NO、TNF-α 和ROS 的測定

1.3.9.1 NO 測定 通過Griess 法測定RAW264.7細胞釋放NO[28]。 參照1.3.8 節方法將細胞接種于細胞培養板中。 經過夜培養后， 分別向貼壁的RAW264.7 細胞中加入100 μL 不同質量濃度 （0～100 μg/mL）的多糖樣品溶液，設置空白對照和陽性對照組， 并以0 μg/mL 質量濃度的多糖處理組為陰性對照， 多糖樣品溶液每個濃度和各對照組均做3～5 個平行，于37 ℃、5% CO2的條件下培養24 h 后，每孔取出50 μL 培養上清液置于新的96孔細胞培養板中，然后向上清液中加入100 μL 的Griess 試劑 （含3 mmol/L 磺胺酸，30 mg/L N-1-（萘基）乙二胺二鹽酸鹽， 質量分數25%的冰醋酸），室溫避光孵育20 min 后，檢測540 nm 下的吸光值（OD540）。 同時，用不同濃度的NaNO2標準溶液繪制標準曲線，計算培養上清液中NO 濃度。

1.3.9.2 TNF-α 測定 采用ELISA 測定RAW264.7細胞分泌的TNF-α[3]。 細胞接種方法參照1.3.8 節中方法，用不同質量濃度（0～100 μg/mL）的多糖樣品溶液在37 ℃、5% CO2的條件下處理培養板中貼壁的RAW264.7 細胞24 h 后，每孔取出4 μL 培養上清液用含有4% BSA 的PBS 溶液稀釋50倍，然后，根據Mouse TNF-α Colorimetric ELISA kit 說明手冊所示的操作步驟對稀釋后培養上清中TNF-α 進行定量測定。 同時，利用不同濃度的TNF-α 標準溶液繪制標準曲線， 計算培養上清液中TNF-α 的含量。

1.3.9.3 ROS 測定 多糖誘導RAW264.7 細胞產生ROS 采用NBT 還原法檢測[29-30]。 將RAW264.7細胞接種于24 孔細胞培養板（5×106細胞/孔）中。經貼壁培養后， 用含Ca2+和Mg2+的Hank’s Balanced Salt Solution （HBSS）輕輕沖洗貼壁細胞2次，分別向每孔加入450μL 的不同質量濃度（0～100 μg/mL）的多糖樣品溶液在37 ℃、5% CO2的條件下誘導RAW264.7 細胞。10 min 后，每孔加入NBT 溶液（質量分數為0.25%）。 經1 h 繼續培養，用HBSS 輕輕洗去每孔過量NBT 溶液， 加入600 μL 的DMSO 充分溶解細胞中的甲瓚，再加入700 μL 的2 mol/L KOH 溶液混勻顯色， 檢測630 nm波長下的吸光值（OD630）。

1.3.10 多糖誘導RAW264.7 細胞釋放NO 及分泌TNF-α 信號通路分析[31]將RAW264.7 細胞接種于96 孔細胞培養板中， 細胞接種參照1.3.8 節中方法。 分別用50μL 的含U0126（ERK）、SB203580（P38）、SP600125（JNK）和PDTC（NF-κB）不同細胞信號通路抑制劑的DMEM 生長培養基預處理貼壁的RAW264.7 細胞1 h， 抑制劑終濃度為20 μmol/L，然后加入50 μL 的多糖樣品溶液（質量濃度為20 μg/mL），設置只用多糖樣品處理的陽性對照組、 不加多糖樣品陰性對照組和只用各抑制劑處理的空白對照組，每組設置3～5 個平行試驗。將加樣后的細胞置于37 ℃、5.0% CO2的條件下培養24 h，取培養上清分別按照1.3.9 節中Giress 法和ELISA 法測定培養上清中RAW264.7 細胞釋放出NO 和分泌出TNF-α 的含量。

2 結果與分析

2.1 多糖的分離純化

紅毛藻粗多糖采用Sevage 法脫除蛋白質后，經過陽離子交換柱層析初步純化后， 上樣Sephadex G75 凝膠柱層析，用濃度為0.1 mol/L 的NaCl 溶液進行洗脫，結果如圖1a 所示，紅毛藻粗多糖的洗脫曲線得到單一對稱峰，命名為BFP；將多糖BFP 上樣于DEAE-cellulose 52 層析柱，用不同濃度的NaCl 溶液進行梯度洗脫， 結果如圖1b 所示。 當NaCl 溶液濃度為0.1，0.3，0.5 mol/L時，各有一個洗脫峰出現，收集各洗脫峰溶液，分別命名為F1、F2 和F3。

2.2 紅毛藻多糖的基本組成結果

由表1 可知， 與標準單糖出峰的保留時間相比較， 多糖BFP 及多糖組分F1、F2 和F3 均為雜多糖。 Jiang 等[15]報道表明BFP 的單糖組成主要為Gal、Man、Glc 和糖醛酸， 并含有少量Fuc、Xyl 和Ara，其物質的量比為11.23∶1.02∶1.00∶2.36∶0.34∶0.35∶0.16 （Glc 的物質的量為1.00）。 本研究表明F1 主要由Gal、Man、Glc、糖醛酸、Ara 和Fuc 組成， 其物質的 量比為1.43 ∶0.62 ∶1.00 ∶0.31 ∶0.51 ∶0.50；F2 主要由Gal、Man、Glc、糖醛酸和Ara 組成，其物質的量比為1.14∶1.38∶1.00∶0.37∶1.12；F3的主要單糖組成為Man、Glc 和Ara， 并含有少量的糖醛酸和Gal，其物質的量比為0.53∶1.99∶1.00∶2.92∶1.06。BFP、F1、F2 和F3 中硫酸根含量分別為10.34%，2.73%，3.09%和2.20%， 含有少量蛋白質（分別占0.31%，0.14%，0.15%和2.19%）， 且幾乎不含多酚。平均分子質量分析結果表明，多糖BFP分子質量為43.16 ku，而組分F1、F2 和F3 分子質量分別為2.07，32.07 和28.32 ku。

圖1 紅毛藻多糖Sephadex G75 凝膠過濾層析洗脫曲線圖（a）和DEAE-cellulose 52陰離子交換柱層析洗脫曲線圖（b）Fig.1 Elution profile of polysaccharide isolated from B. fusco-purpureaon on a Sephadex G75 gel permeation chromatography （a）and gradient elution profile of BFP on a DEAE-cellulose 52 anion exchange chromatography（b）

表1 BFP、F1、F2 和F3 的單糖、硫酸基團組成和分子質量Table 1 Monosaccharide compositions， sulfate group compositions and molecular mass of BFP， F1， F2 and F3

2.3 BFP、F1、F2 和F3 的紅外光譜學特征

由圖2 可得，在3 400 cm-1處的寬強峰是分子內O-H 的伸縮振動的吸收峰，由于分子內羥基間形成氫鍵而使吸收峰變寬[32]；在3 000～2 800 cm-1區較弱的吸收峰和1 400～1 200 cm-1區較寬的吸收峰是C-H 伸縮振動吸收和變角振動吸收，這兩個區域的吸收峰是糖類的特征吸收峰[33]；1 230 cm-1處是硫酸基中S=O 的伸縮振動吸收[34-35]，BFP、F1、F2 在此吸收峰較強， 說明F1、F2 含較多的硫酸根，F3 硫酸根含量較低， 這與上述化學分析的結果一致；1 200～1 000 cm-1間的強吸收峰是由兩種C-O 伸縮振動所引起的， 一種屬于C-O-H，另一種是糖環C-O-C[36]；沒有930 cm-1處的吸收峰， 提示BFP、F1、F2 和F3 不含或很少含有3，6-內醚-L-半乳糖[37]。 892 cm-1處的弱帶則表明存在α-糖苷鍵[38]。 在820 cm-1處的吸收峰可能是由D-半乳糖的C-6 位的硫酸根基團引起的[34]。 F1、F2、F3 在1 740 cm-1處吸收峰較弱表明含少量糖醛酸，BFP 有較強峰表明糖醛酸含量較高[38]。 在1 633 cm-1和1 644 cm-1處的獨特吸光度強烈表明BFP、F1、F2 和F3 中的羧基[39]。

2.4 紅毛藻多糖對RAW264.7 細胞活力的影響

由圖3 可知， 在本文所設定的多糖質量濃度（0～100 μg/mL）和作用時間（24 h）范圍內，BFP、F1、F2 和F3 對細胞活力沒有顯著的影響。

圖2 BFP、F1、F2 和F3 的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra characteristics of BFP， F1，F2 and F3

2.5 紅毛藻多糖誘導RAW264.7 細胞活化釋放免疫因子NO、TNF-α 和ROS 的結果

多糖樣品誘導細胞釋放的NO 溶于細胞培養上清液形成NO2-， 以細胞上清液中NO2-濃度表示樣品誘導細胞釋放NO 的活性，其結果如圖4a 所示： 多糖BFP、F1、F2、F3 在所測定質量濃度 （0～100 μg/mL）范圍內顯著誘導RAW264.7 細胞活化釋放NO，與陰性對照組相比差異極顯著（P<0.01），且BFP、F1、F2、F3 誘導RAW264.7 細胞釋放NO 能力在多糖質量濃度為0～12.5 μg/mL 范圍內呈現濃度依賴性， 隨著多糖質量濃度的升高而增加； 當多糖質量濃度為0～6.25 μg/mL 時，BFP、F1、F2、F3 誘導細胞釋放NO 的量開始呈現出F2＞F1＞F3＞BFP 的差異；當多糖質量濃度為12.5～100 μg/mL 時，BFP、F1、F2、F3 誘導細胞釋放NO量趨于平穩，不呈現多糖質量濃度依賴性。

圖4b 表明，多糖BFP、F1、F2、F3 在所測定質量濃度（0～100 μg/mL）范圍內顯著誘導RAW264.7細胞活化分泌TNF-α， 其活性呈現多糖質量濃度依賴性；多糖組分F1 和F2 誘導細胞分泌TNF-α的量與陰性對照組相比差異極顯著 （P<0.01）；多糖BFP 和組分F3 在質量濃度為25～100 μg/mL時，其誘導細胞分泌TNF-α 的量與陰性對照組相比，存在極顯著差異性（P<0.01），而BFP 和F3 的質量濃度為12.5 μg/mL 時， 其誘導RAW264.7 細胞分泌TNF-α 活性與陰性對照組相比差異顯著（P<0.05），當多糖質量濃度為0～6.25 μg/mL 時，無顯著差異。

圖3 BFP、F1、F2 和F3 對RAW264.7 細胞活性的影響Fig.3 Effects of BFP， F1， F2 and F3 at different concentrations on the viabilities of RAW264.7 cells

紅毛藻多糖誘導RAW264.7 細胞活化產生ROS 的結果是通過溶解其胞內的甲瓚， 并以在630 nm 處的吸光值OD630來表示， 其結果如圖4c所示。 多糖質量濃度為0～100 μg/mL 的范圍內，BFP、F1、F2 和F3對細胞產生ROS沒有顯著影響， 表明BFP、F1、F2 和F3 在所測定質量濃度范圍內沒有誘導RAW264.7 細胞產生ROS 的活性。

2.6 不同信號通道抑制劑對紅毛藻多糖誘導RAW264.7 細胞活化釋放NO 和分泌TNF-α的影響

MAPK 信號通路和NF-κB 信號通路在巨噬細胞活化釋放NO 和分泌TNF-α過程中起重要作用[40-41]。 為闡明MAPK 和NF-κB 信號傳導通路是否參與紅毛藻多糖誘導RAW264.7 細胞活化釋放NO 和分泌TNF-α，本文利用ERK MAPK （U0126）、JNKMAPK（SP600125）、p38 MAPK（SB203580）的3 種經典MAPK 信號通路特異性抑制劑和NF-κB信號通路特異性抑制劑PDTC 分別預處理細胞，阻斷相應信號通路， 來分析參與紅毛藻多糖誘導RAW264.7 細胞活化釋放NO 和分泌TNF-α 的相關細胞信號通路。 抑制劑對BFP、F1、F2 和F3 誘導細胞活化釋放NO 和分泌TNF-α 的結果如表2和表3 所示。 抑制劑SP600125 和PDTC 均顯著抑制BFP、F1、F2 和F3 誘導細胞活化釋放NO，而抑制劑U0126 只顯著抑制 BFP 誘導細胞活化釋放NO （表1）。 抑制劑SP600125 和U0126 均顯著抑制BFP、F1、F2 和F3 誘導細胞活化分泌TNF-α。抑制劑SB203580 只顯著抑制BFP 和F1 誘導細胞活化分泌TNF-α，而PDTC 對F1 誘導細胞活化分泌TNF-α 無明顯的抑制作用（表2）。 以上結果表明，BFP 主要通過誘導RAW264.7 細胞中NFκB、JNK MAPK 和ERK MAPK 信號通路活化釋放NO，而誘導NF-κB、ERK MAPK 和p38 MAPK 信號通路活化分泌TNF-α；F1 主要通過誘導細胞中的NF-κB、和JNK MAPK 信號通路活化使細胞釋放NO，通過誘導JNK、ERK 和p38 MAPK 信號通路活化分泌TNF-α；F2 和F3 作用機制相似，主要通過激活細胞的NF-κB 和JNK MAPK 信號通路使細胞釋放NO， 并通過誘導細胞中NF-κB、JNK MAPK 和ERK MAPK 信號通路活化分泌TNF-α。

圖4 不同質量濃度（0～100 μg/mL）的BFP、F1、F2 和F3 誘導RAW264.7 細胞活化產生NO （a）、TNF-α （b）和ROS （c）的水平Fig.4 NO （a）， TNF-α （b）and ROS （c）levels in RAW264.7 cells induced by various concentration （0～100 μg/mL）of BFP， F1， F2 and F3

表2 抑制劑對BFP、F1、F2 和F3 誘導RAW264.7 細胞產生NO 的影響aTable 2 Effects of inhibitors on the BFP， F1， F2 and F3 induced NO production from RAW264.7 cellsa

表3 抑制劑對BFP、F1、F2 和F3 誘導RAW264.7 細胞產生TNF-α 的影響aTable 3 Effects of inhibitors on the BFP， F1， F2 and F3 induced TNF-α production from RAW264.7 cellsa

3 結論

從紅毛藻中提取多糖BFP 經陽離子交換柱層析、 再經Sephadex G75 凝膠過濾柱層析和DEAE-cellulose 52 陰離子交換柱分離純化得到3個多糖組分：F1、F2 和F3。多糖組成分析結果表明BFP、F1、F2 和F3 均為雜多糖且單糖組成存在較大差異（表1）。 分子質量分析結果表明，4 個片段分子質量相差較大， 其中BFP 分子質量為43.16 ku，而F1、F2 和F3 片段分子質量分別為2.07，32.07和28.32 ku。 活性研究結果表明BFP、F1、F2 和F3均能夠顯著誘導RAW264.7 細胞活化釋放NO 和分泌TNF-α，并且組分F1 和F2 的活性顯著高于多糖BFP 和F3， 說明F1 和F2 是BFP 中具有免疫誘導活性的主要活性組分。 通過進一步分析多糖誘導細胞活化的胞內信號轉導通路， 推測紅毛藻多糖BFP 共同通過誘導NF-κB 和ERK MAPK信號通路使RAW264.7 細胞活化釋放NO 和分泌TNF-α，BFP 通過分別激活細胞中JNK 和p38 MAPK 釋放NO 和分泌TNF-α；F1 主要通過JNK MAPK 信號通路活化RAW264.7 細胞釋放NO 和分泌TNF-α，F1 通過分別誘導細胞中NF-κB 和ERK、p38 MAPK 活化釋放NO 和分泌TNF-α；F2和F3 主要通過NF-κB 和JNK MAPK 信號通路誘導細胞活化釋放NO， 并通過NF-κB、JNK MAPK 和ERK MAPK 信號通路誘導細胞活化分泌TNF-α。