豬鏈球菌2型臨床分離株的分離鑒定和生物學特性分析

夏 葉，鄭琳琳，李春華，郭佳宏，凌紅麗，蔣貽海，繆德年*

(1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2上海市農業科學院上海種豬工程技術研究中心，上海 201106；3青島蔚藍生物股份有限公司，青島 266001)

豬鏈球菌病(swine streptococcosis)是一種重要的人畜共患傳染病，會引起豬腦膜炎、關節炎、敗血癥、流產及仔豬突然死亡等[1]，人通過接觸污染的生肉產品或患病動物而引發感染，嚴重者會發生中毒性休克甚至死亡[2]。該病不僅危害養豬業的發展，也對從業人員的健康造成威脅，危害公共衛生安全。豬鏈球菌(Streptococcussuis)是引起豬鏈球菌病的病原菌，該菌為革蘭氏陽性菌，兼性厭氧。根據莢膜多糖抗原的不同，豬鏈球菌分為35個血清型：1—34型及1/2型。其中豬鏈球菌2型流行最廣、毒力最強，是最易引發人和動物感染的血清型[3-4]。

不同豬鏈球菌菌株之間的致病力存在顯著差異，這種差異可能與菌株的毒力基因分布有關。豬鏈球菌的主要毒力基因包括谷氨酸脫氫酶gdh(glutamate dehydrogenase)、溶菌酶釋放蛋白mrp(muramidase-released protein)、胞外因子epf(extracellular protein factor)、溶血素sly(suislysin)、莢膜多糖cps(capsular polysaccharide)、毒力相關序列orf2(virulent-assocciated sequence)以及纖連蛋白原結合蛋白fbps(fibronectin-binding proteins)[5-6]。不同地區分離株的毒力基因分布具有差異性。gdh基因存在于所有的豬鏈球菌菌株中，且GDH蛋白在抗原性上具有較好的種屬特異性，可作為檢測豬鏈球菌的標識[7]。本研究擬通過PCR和生化方法鑒定分離株及其毒力基因分布，并對該分離株進行耐藥性檢測，以期為臨床防治、監管和治療豬鏈球菌病提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)培養基購自英國Oxoid有限公司；血平板和革蘭氏染色液購自廣東環凱生物有限公司；細菌微量發酵管和藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；2×Taq MasterMix、DNA Marker和DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；Gold View核酸染料購自北京賽百勝生物技術公司。

1.2 病料來源

病料組織采集于江蘇某大型規?；i場中典型發病仔豬的關節液及腦脊液。

1.3 病原菌的分離培養

無菌采集發病仔豬的關節液和腦脊液，接種至TSA血平板，37℃培養24h后觀察細菌的培養情況。挑取典型單菌落接種至TSB液體培養基，37℃搖床培養12h。將純培養的細菌進行革蘭氏染色、鏡檢，并對陽性菌進行傳代純化。

1.4 生化試驗

將純培養的細菌接種于微量發酵管內，37℃培養24 h，觀察其產酸、產氣的生化反應。

1.5 引物設計與合成

參照Tang等[8]的報道，合成豬鏈球菌管家基因gdh和重要毒力基因sly、epf、mrp的引物序列，鑒定該分離株是否為豬鏈球菌。參照Smith等[9]的報道，合成豬鏈球菌1型和2型分型基因cpsI1和cps2J的引物，進行分型鑒定。引物(表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 PCR反應引物

1.6 基因組DNA的提取

過夜培養的細菌經PBS洗滌后離心收集菌體，按照DNA提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA待用。

1.7 管家基因及血清分型鑒定

以上述DNA為模板，進行管家基因gdh以及分型基因cpsI1和cps2J的PCR擴增。PCR反應體系：2×Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，dd H2O補齊至總反應體系為20 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，53℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.8 毒力基因檢測

以上述DNA為模板，進行3種主要毒力基因的PCR擴增。PCR反應體系：2×Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物(10μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補齊至總反應體系為20 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.9 藥敏檢測

采用藥敏試紙擴散法進行分離株的藥敏試驗。將過夜培養的分離株液體培養物均勻涂布于TSA血平板，將藥敏試紙貼于血平板上，37℃培養24 h，測定抑菌圈直徑，根據藥敏試紙說明書對分離株的藥敏結果進行判定。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離

分離菌在血平板上呈現直徑0.1—1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊的圓形小菌落，呈 α 溶血(圖1A)；革蘭氏染色為陽性，菌落呈單個、成對或短鏈存在(圖1B)，命名為HA21。

2.2 生化試驗

該分離株能發酵果糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖產酸，為陽性反應；發酵蔗糖、麥芽糖、山梨醇、阿拉伯糖不產酸，為陰性反應，與豬鏈球菌的生化反應結果相符。

2.3 管家基因及血清分型鑒定

PCR結果顯示：該分離株管家基因gdh的鑒定結果為陽性(圖2)，確定該分離菌為豬鏈球菌；分型基因cpsI1鑒定結果為陰性，cps2J鑒定結果為陽性，確定該分離菌為豬鏈球菌2型(圖3)。

2.4 毒力基因分布分析

采用PCR方法檢測到該分離株主要毒力基因的分布情況為sly+/mrp+/epf+(圖4)。其中，目的片段Sly的條帶大小為248bp，mrp的條帶大小為885bp，epf的條帶大小為442bp，與預期相符。

2.5 藥敏檢測結果

該分離株對青霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢拉定、先鋒霉素、氧氟沙星敏感，對慶大霉素、環丙沙星中度敏感，對卡那霉素、壯觀霉素、阿奇霉素、林可霉素、鏈霉素、紅霉素不敏感。

3 討論

豬鏈球菌病是危害我國養豬業的重要細菌性疾病之一。近年來，豬鏈球菌病多次在國內暴發，特別是四川、江蘇、廣東等養殖大省[10-11]，造成重大經濟損失，危害公共衛生安全。在35種豬鏈球菌血清型中，1型、1/2型、2型、7型、9型和14型為主要血清型，目前我國最流行的血清型為豬鏈球菌2型，多次爆發的疫情均為2型感染[12]。本研究中分離得到的菌株經形態、生化試驗和PCR鑒定，確定為豬鏈球菌2型。

Vecht等[13]認為，雖然豬鏈球菌存在多種毒力相關因子，但sly、mrp和epf這3個毒力基因被認為是判定豬鏈球菌2型毒力強弱的指標。一般認為強毒株的毒力基因分布為mrp+/sly+/epf+，從發病豬體內分離得到的菌株普遍為強毒株；而弱毒株的毒力基因分布為mrp-/sly-/epf-，從健康豬體內分離得到的菌株通常為弱毒株。然而，近幾年Gottschalk等[6]從發病豬體內分離得到的多個豬鏈球菌2型分離株的毒力基因分布表現為mrp-/+/sly-/epf-。Dong等[14]發現mrp+的分離株也存在低毒力表型，而mrp-也存在高毒力表型。本研究中的豬鏈球菌為從病死豬體內分離得到，其毒力基因分布為sly+/mrp+/epf+，推斷該分離株HA21可能為強毒株。

目前，對豬鏈球菌病的治療和預防手段主要是抗生素防治。但隨著抗生素的使用越來越廣泛、劑量越來越大，菌株的耐藥性也隨之增高，導致利用抗生素防控豬鏈球病的難度越來越大。本研究通過對臨床分離的豬鏈球菌HA21進行藥敏分析，發現其對青霉素、阿莫西林、頭孢拉定等β-內酯酰胺類抗生素敏感；對卡那霉素、鏈霉素、紅霉素等抑制細菌蛋白質生物合成的抗生素耐藥性嚴重。因此，該豬場對豬鏈球菌病的用藥應以青霉素為主，頭孢類藥物為輔，選擇性的輪換用藥，避免產生抗生素耐受。定期的藥敏檢測可避免飼養過程中的抗生素濫用，指導發病時的臨床用藥，并防止耐藥菌株甚至超級細菌的產生。由于豬體的耐藥基因可通過接觸或食物鏈等方式傳遞給人類，因此對菌株的耐藥性監測不僅對豬場的疾病防治具有指導作用，對人類及公共衛生安全也有重大意義。