LRH-1的小分子激活劑DLPC對牛卵巢顆粒細胞類固醇合成基因表達的影響

蔣小涵 , 徐德軍,李 曼，李青旺*，耿果霞

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學 動物醫學院，陜西 楊凌712100)

卵巢顆粒細胞(Granulosa cells, GCs)是卵泡當中合成類固醇激素最重要的體細胞，類固醇激素對卵泡的生長發育以及調控卵母細胞成熟有重要作用[1]。STAR是類固醇激素合成的急速調節蛋白，對類固醇激素合成具有重要限速作用[2]，CYP17是雌激素合成的相關基因CYP17A1編碼細胞色素 P450-17α酶，是類固醇激素合成途徑中關鍵酶，CYP17為雌二醇合成的相關基因[2]。CYP11A1基因編碼的膽固醇側鏈裂解酶，簡稱P450scc，是孕酮激素合成的關鍵酶，其催化膽固醇為孕烯醇酮，啟動生物體內類固醇激素合成的第一步[3]。

LRH-1(肝受體同系物1)又名NR5A2[4]，是核受體家族的成員，作為轉錄共激活子調控基因的表達[5]，LRH-1在排卵以及類固醇合成中都是必須的。雌性哺乳動物中，LRH-1在卵巢中比在任何其他組織中更豐富，并且主要在GCs(原發性至排卵前卵泡)和卵巢CLs中表達[6-7]。研究者通過特異性LRH-1敲除小鼠模型，發現LRH-1對胚胎發育[8]，卵泡成熟，卵泡類固醇合成和排卵[9]有重要作用。然而，LRH-1對GCs類固醇激素相關基因表達水平的作用仍然未知。因此，本試驗利用免疫組化研究LRH-1在牛卵巢組織中的表達定位；并利用LRH-1特異性激活劑DLPC處理卵巢顆粒細胞，RT-qPCR檢測LRH-1激活對STAR、CYP17和CYP11等類固醇激素合成相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 卵巢的來源

本試驗所用的樣品牛卵巢來源于陜西西安某屠宰場，采用商品化的2～4歲的秦川母牛為樣本，樣品選取大小為2～8 mm的中小卵泡，采集的牛卵巢置于滅菌的PBS(含10 IU/mL雙抗，37 ℃)中，處理后，移入無菌操作臺中。

1.2 主要試劑

DMEM/F12、Insulin、BSA、亞硒酸鈉、非必需氨基酸購買自Sigma，CCK-8增值凋亡試劑盒(Vazyme)，DLPC(美國APE&BIO生物公司)，Tirzol購自Takara，RNA反轉錄試劑購自abm公司，FSH購自寧波第二激素廠，轉鐵蛋白購自Solaibao生物有限公司。

1.3 牛卵巢顆粒細胞分離培養

用注射器吸取中小卵泡，將400目的細胞篩網潤濕，過濾離心5 min。培養液重懸牛卵巢顆粒細胞，將沉淀收集在離心管中，加入完全培養基(3% BSA、50 ng/mL Insulin、0.1 IU/mL FSH、100×青鏈霉素雙抗、50 ng/mL亞硒酸鈉、轉鐵蛋白50 ng/mL、非必需氨基酸100×)懸浮細胞，采用臺盼藍計數法將細胞密度調整至1×106/mL，稀釋細胞，接種并放入恒溫培養箱中培養(37 ℃)。培養至48 h后收集生長至對數期的牛卵巢顆粒細胞[10]。

1.4 免疫熒光化學法

顆粒細胞中會表達有特異性的促卵泡激素受體(FSHR)，使用免疫熒光法鑒定分離培養的牛卵巢顆粒細胞。所用卵泡激素受體FSHR購買于武漢博士德公司，4%多聚甲醛固定顆粒細胞。Triton X-100 (0.2%)反應20 min，室溫滴加3% FBS封閉1 h，再加入稀釋好的FSHR，4 ℃過夜孵育，室溫滴加適量熒光標記的二抗反應1 h。DAPI反應5 min，封片，鏡檢。

1.5 免疫組織化學法

將牛卵巢組織塊用4%的多聚甲醛4 ℃過夜浸泡。用PBS-Twen-20(PBST)沖洗。將組織切片放入修復盒中10～15 min。滴加3% BSA，室溫封閉1 h，滴加稀釋好的一抗，4 ℃過夜，同時用一抗來源動物未免疫前的血清作為陰性對照；滴加適量一定濃度的二抗，室溫孵育30 min；滴加適量DAB溶液，之后滴加適量蘇木素復染1.5～2 min，脫水。中性樹膠封片，鏡檢[11]。

1.6 顆粒細胞總RNA提取以及實時定量PCR

Trizol方法提取顆粒細胞總RNA[13]，用abm的反轉錄試劑盒合成cDNA。引物(如表1)設計全部在NCBI網站上完成，GAPDH作為內參基因，以2-ΔΔCT法分析RT-qPCR結果。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 統計分析

采用SPSS20.0軟件進行數據分析，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 牛卵巢顆粒細胞的體外分離培養

分離培養的牛卵巢顆粒細胞在培養初期呈圓形，培養24 h貼壁，培養24～48 h時，顆粒細胞增長迅速，待顆粒細胞增長密度>70%時，細胞顏色透亮，形態良好，細胞團增長明顯，方可進行后續試驗(如圖1)。

2.2 牛卵巢顆粒細胞鑒定

由于顆粒細胞特異性表達FSHR蛋白，紅色熒光標記的細胞，為表達FSHR陽性的細胞(圖2)，藍色熒光區域為DAPI。通過標記FSHR以及細胞核，可以直觀地看出顆粒細胞的分布及表達FSHR的牛卵巢顆粒細胞，統計可得，表達FSHR的牛卵巢顆粒細胞陽性率>95.5%，試驗結果說明經過分離培養的牛卵巢顆粒細胞純度達到95.5%，為下一步牛卵巢顆粒細胞試驗奠定了基礎。

圖1 體外培養牛卵巢顆粒細胞24 h(10×)

圖2 牛卵巢顆粒細胞免疫熒光鑒定

2.3 免疫組織化學法檢測LRH-1在牛卵巢組織中的表達定位

棕色為表達LRH-1的牛卵巢顆粒細胞(如圖3B)，藍色部分為未表達LRH-1的細胞(如圖3A)，試驗結果表明LRH-1在顆粒細胞中高度表達，在其他細胞中表達不高。

圖3 牛卵巢免疫組織化學

2.4 LRH-1對牛顆粒細胞類固醇激素分泌相關基因mRNA水平表達的影響

不同濃度(20 μM、50 μM、100 μM、150 μM、200 μM)的DLPC處理牛卵巢顆粒細胞。與對照組相比，50 μM DLPC顯著促進STAR、LRH-1、CYP17基因的mRNA表達(P<0.05,圖4)，50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM的DLPC顯著抑制了CYP11基因的表達量(P<0.05)。結果表明LRH-1表達上調促進了雌激素合成酶CYP17基因的表達，抑制了孕酮合成限速酶CYP11基因的表達。

圖4 不同濃度(20 μM、50 μM、100 μM、150 μM、200 μM)的DLPC對STAR、CYP11、LRH-1的基因表達的影響

3 討 論

LRH-1基因編碼的蛋白質是DNA的鋅指轉錄因子，也是孤核受體家族成員。LRH-1調節膽固醇機制、類固醇生成、細胞增殖和干細胞多能性。卵巢特異性敲除SF-1會破壞卵泡發育，而LRH-1特異性敲除可阻礙卵泡排卵、卵丘擴張和黃體化。LRH-1孤核受體是生殖組織的關鍵調節因子[13]。LRH-1編碼的蛋白質參與乙型肝炎病毒和膽固醇生物合成的基因表達，LRH-1可能是胚胎發育的重要調節因子。

選擇適宜的培養基可以影響細胞增殖、分化以及細胞衰老的時間，本試驗建立了牛卵巢顆粒細胞無血清培養體系，克服了細胞自發黃體化，并利用該系統研究了類固醇的合成及細胞的增殖凋亡等一系列生理反應。有研究表明，使用含血清的培養基培養細胞，可能使細胞處于發育或閉鎖的不同階段，其中血清可能會抑制和誘導細胞分裂[14]，所以有必要開發牛卵巢顆粒細胞體外無血清培養體系，以便研究顆粒細胞對卵泡的調控機制。

類固醇激素對維持雌性動物的生殖生理有至關重要的作用[15]。Manna等[16]發現，類固醇的合成對卵泡閉鎖有至關重要的作用；Mendelson等[17]報道了LRH-1基因敲除的小鼠胚胎未能形成原腸胚，LRH-1在成年人的胃腸道、肝臟、胰腺及卵巢中表達，它調節類固醇生成。但LRH-1在牛卵巢顆粒細胞參與類固醇激素的調控機制的研究闡明較少。Sirianni等[18]研究表明，線粒體中CYP11A1產生的孕烯酮可以被CYP17羥基孕烯酮所代替，也可以被HSD3β2代替。Hohenester[19]報道添加激活劑DLPC會特異性地結合LRH-1的配體結合域，體外培養條件下，DLPC可以有效地激活人與小鼠LRH-1的表達，而不影響其它核受體表達，DLPC可能成為一種治療代謝性疾病的藥物[20]。本試驗采用RT-qPCR法檢測LRH-1的mRNA基因表達，50 μM DLPC顯著提高LRH-1基因表達(P<0.05)，與Lee等[20]報道一致。Sirianni[18]進一步研究表明，LRH-1與SF-1在大多數類固醇合成組織中表達，調節多種類固醇代謝酶的表達，LRH-1可以促進基因的轉錄，從而參與類固醇激素生成的限速步驟和反應，50 μM DLPC顯著提高STAR基因的表達，與文獻報道一致。但20 μM DLPC抑制CYP11A1的表達，可能是LRH-1的小分子激活劑DLPC抑制CYP11A1的表達進而抑制孕酮激素的分泌。Sidler等[21]研究表明LRH-1在CRC細胞系中過表達，促進了類固醇生成酶CYP11A1和CYP11B1的表達，同時增加了免疫調節皮質類固醇的水平。本試驗添加50 μM的DLPC，顯著提高STAR、CYP11A1的表達，與文獻報道一致。

4 結 論

LRH-1在牛卵巢顆粒細胞中高度表達，50 μM DLPC可顯著提高牛卵巢顆粒細胞LRH-1、STAR、CYP17基因的表達，20 μM DLPC可顯著抑制牛卵巢顆粒細胞孕酮合成相關CYP11基因的表達。