中華絨螯蟹抱卵前后脂肪酸和氨基酸組成的比較

姬慧 馮廣朋 宋超 王海華

摘要：為研究中華絨螯蟹抱卵前后體成分變動規律，測定分析了雌蟹抱卵前后不同組織（性腺、肝胰腺、肌肉）中的脂肪酸和氨基酸的變動。結果表明，抱卵前肝胰腺指數（7.31±0.73）顯著高于抱卵后（5.59±0.82）（P<0.05）。在肌肉和肝胰腺中，抱卵前飽和脂肪酸（SFA）和單不飽和脂肪酸（MUFA）百分量均顯著高于抱卵后（P<0.05），其中脂肪酸C16∶00和C18∶1n9百分量最高;抱卵前多不飽和脂肪酸（MUFA）中C18∶2n6和C18∶3n3百分量顯著高于抱卵后（P<0.05），但EPA（C20∶5n3）和DHA（C22∶6n3）百分量低于抱卵后。與抱卵前相比，抱卵后雌蟹肝胰腺和肌肉中氨基酸含量均顯著升高（P<0.05），其中谷氨酸含量最高、半胱氨酸含量最低。研究結果揭示，脂肪是中華絨螯蟹雌蟹繁殖前期的主要能源代謝底物，氨基酸在繁殖期逐漸積累。

關鍵詞：中華絨螯蟹;抱卵蟹;生化成分;氨基酸;脂肪酸

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）是洄游性的經濟物種，具有重要的養殖和食用價值[1]。長江水系野生種群味道鮮美、營養豐富、風味獨特，其可食組織的不飽和脂肪酸和蛋白質含量高[2]，相比其它水系野生河蟹，其養殖規模最大[3]。近年來，由于過度捕撈、濕地圍墾、環境污染等原因，造成天然河蟹資源迅速衰退[4]。繁殖期是動物延續種群的重要生活史階段，為保護和恢復長江口野生河蟹資源，許多研究者對繁殖階段的中華絨螯蟹開展了多方面研究工作，如親蟹增殖放流[5]、產卵場生境評估[6]、食性[7]、胚胎發育[8]等方面。

動物的能量一般分配為三部分：維持個體基本生存、生長發育和繁殖[9， 10]，對于性成熟個體而言，投入到生長發育中能量較少，除部分能量用于維持基本生存外，大部分能量均投入到繁殖中[11]。蛋白質和脂質作為中華絨螯蟹機體提供能量的主要物質載體，對其繁殖力、受精率、孵化率等繁殖活動具有重要作用[12， 13]。肌肉和肝胰腺是甲殼動物的重要供能組織，其中肝胰腺在甲殼動物中被認為是營養物質消化吸收和儲存的器官[14]，其能量物質載體的變動一定程度上能夠反映機體對能量的利用模式。多數研究表明，氨基酸和脂肪酸在水生動物繁殖期間被利用的先后順序因物種而存在差異，如Gendron等[15]報道了繁殖期美洲龍蝦（Homarus americanus）的主要代謝能源為蛋白質，劉凱等[16]報道了繁殖期太湖秀麗白蝦的主要代謝能源為脂肪。目前，對長江口中華絨螯蟹繁殖期脂肪酸和氨基酸的研究相對較少。因此，本研究通過比較長江口中華絨螯蟹抱卵前后不同組織（性腺、肝胰腺、肌肉）中脂肪酸和氨基酸的變化規律，以期為闡述中華絨螯蟹的繁殖生理學，種群生態學提供一些基礎數據，為長江口中華絨螯蟹的種質資源保護提供參考依據。

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

實驗所用的中華絨螯蟹雌蟹均采自長江口（121°57′33.76″E， 31°23′33.41″ N），抱卵前和抱卵后的雌蟹樣品采集后，分別作為2個實驗組，每個實驗組分別挑選出體重相似、個體健壯、附肢完整的個體各15只，首先將蟹檫干體表水分，用電子天平進行稱重，用游標卡尺對蟹進行殼長和殼寬的測量，然后將每只蟹在冰盤上依次進行活體解剖，分別取出肝胰腺、肌肉和性腺，稱取組織重量，用于計算肝胰腺指數（hepatosomatic index， HSI）和性腺指數（gondosomatic index， GSI）。稱重后立即保存于-80 ℃冰箱中用于生化測定。測定時將樣品在105 ℃下烘干，磨碎，混合均勻，然后將樣品分成兩份，一份做常規生化成分分析，另一份做氨基酸和脂肪酸的測定。

抱卵前雌蟹平均體重為60.91±1.95 g，平均殼長為47.45±5.08 mm，平均殼寬為52.45±5.45 mm;抱卵后雌蟹平均體重為86.41±4.29 g，平均殼長為51.20±2.25 mm，平均殼寬為57.40±2.36 mm，卵塊平均重量為22.50±4.78 g。

肝胰腺指數（Hepatosomatic Index，HSI，%）=肝胰腺重/體重×100

性腺指數（Gonad index，GSI，%）=性腺中/體重×100

1.2? 脂肪酸測定

脂肪酸分析依據WU等[17]的方法，采用14%的三氟化硼-甲醇（V∶V）對總脂進行甲酯化處理，旋轉蒸發到所需濃度進行脂肪酸分析。使用5975C-7890A氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS），FFAP彈性石英毛細管柱（30 m×0.53 mm，1μm），進樣口和氫火焰檢測器的溫度分別為270℃和280℃，起始柱溫為50℃，程序逐漸升溫到250℃，直到所有脂肪酸全部出峰。脂肪酸含量的計算采用面積百分比法，每個實驗組樣品均重復測定6次。

1.3? 氨基酸測定

總氨基酸參考CHEN等[18]的方法進行測定。精確稱取烘干后的樣品約0.05 g，置于厭氧水解管中，加入6 mol/L鹽酸5 mL混勻，放入液氮中冷凍，待溶液凝固后取出，在真空泵抽氣管上抽真空封管，然后放入110℃的恒溫干燥箱內水解24 h，水解產物冷卻后用蒸餾水稀釋并定容至10 mL，離心后用0.45 μm水系濾膜過濾除雜，取1 mL過濾后的上清液到試管中，在真空濃縮儀內真空干燥，殘留物用1 mL去離子水溶解，在干燥，反復進行2次，最后加入1 mL pH2.2樣品緩沖溶解，0.22 μm水系膜過濾，使用德國賽卡姆公司S-433D型氨基酸自動分析儀進行測定;參考SPINDLER等[19]方法，采用過蛋氧化水解法測定半胱氨酸含量。

1.4? 數據處理

采用MS Excel 2013軟件對實驗數據進行統計分析，所有數據均以平均值±標準誤差表示。采用SPSS 18.0軟件的單因素方差分析（one-way ANOVA）和獨立樣本T檢驗對實驗數據進行顯著性分析，取P<0.05為差異顯著。

2? 結果與分析

2.1? 抱卵前和抱卵后脂肪酸含量的比較

抱卵前后肝胰腺和肌肉中脂肪酸的變動見表1。在肝胰腺組織中，抱卵前飽和脂肪酸（SFA）中C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0和C18∶0的百分量顯著高于抱卵后（P<0.05）;對于單不飽和脂肪酸（MUFA）而言，抱卵前肝胰腺組織中C15∶1n5、C16∶1n7、C17∶1n7和C20∶1n9百分量均顯著高于抱卵后（P<0.05）;與抱卵前相比，抱卵后肝胰腺組織多不飽和脂肪酸（PUFA）中C18∶2n6和C18∶3n3分別顯著下降2.50%和5.86%（P<0.05），但C20∶4n6（ARA）、C20∶5n3（EPA）和C22∶6n3（DHA）百分量分別升高0.97%、1.53%和15.16%，其中C20∶4n6（ARA）和C20∶5n3（EPA）百分量在抱卵前后肝胰腺中無顯著差異性（P>0.05）。

在肌肉組織中，抱卵前飽和脂肪酸（SFA）中除C14∶0外，C15∶0、C16∶0、C17∶0和C18∶0百分量均顯著高于抱卵后（P<0.05）;對于單不飽和脂肪酸（MUFA）而言，抱卵后肌肉組織中除C16∶1n7百分量（5.14±0.16）顯著高于抱卵前（0.34±0.05）（P<0.05）外，其余單不飽和脂肪酸（MUFA），如C15∶1n5、C17∶1n7和C20∶1n9百分量均在抱卵后顯著下降（P<0.05）;對于多不飽和脂肪酸而言，抱卵前肌肉組織中C18∶2n6、C18∶3n3和C20∶4n6百分量顯著大于抱卵后（P<0.05），但抱卵后肌肉組織中C20∶5n3（EPA） 和C22∶6n3（DHA）百分量顯著高于抱卵前（P<0.05）。

在肝胰腺、性腺和肌肉組織中，抱卵前脂肪酸中除C16∶0、C15∶1n5和C22∶6n3外，3個組織中其余脂肪酸百分量均存在顯著差異（P<0.05）;除C20∶4n6和C20∶5n3外，抱卵前肝胰腺中其余脂肪酸百分量均顯著高于肌肉和性腺組織（P<0.05）。

2.2? 抱卵前和抱卵后氨基酸含量的比較

抱卵前后肝胰腺和肌肉中共檢測出17種水解氨基酸，其中人體必需的氨基酸有9種，非必需氨基酸（NEAA）有8種（表2）。在肝胰腺組織中，抱卵前和抱卵后的9種必需氨基酸（EAA）的含量范圍分別為1.03～6.57 mg·g-1和1.83～17.41 mg·g-1;抱卵后的9種必需氨基酸（EAA）含量均顯著大于抱卵前（P<0.05）;抱卵前肝胰腺中必需氨基酸（EAA）含量最高和最低的均為亮氨酸和半胱氨酸;抱卵后肝胰腺中非必需氨基酸（NEAA）含量均顯著高于抱卵前（P<0.05），抱卵前和抱卵后肝胰腺中8種非必需氨基酸（NEAA）含量范圍分別為2.78～7.63 mg·g-1和8.30～23.09 mg·g-1;抱卵前后肝胰腺中非必需氨基酸（NEAA）含量最高的均為谷氨酸 （15.46 mg·g -1），但抱卵前和抱卵后非必須氨基酸（NEAA）含量最低的分別為脯氨酸（2.78 mg·g-1）和丙氨酸（8.30 mg·g-1）。

在肌肉組織中，抱卵后的必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）含量均顯著高于抱卵前（P<0.05）;抱卵前和抱卵后肌肉中必需氨基酸含量范圍分別為2.80～20.45 mg·g-1和9.58～29.25 mg·g-1;抱卵前和抱卵后肌肉中必需氨基酸（EAA）含量最高和最低的分別均為賴氨酸和半胱氨酸;抱卵前和抱卵后肌肉中非必需氨基酸（NEAA）含量最高的為谷氨酸，但最低的分別為脯氨酸（16.69 mg·g-1）和絲氨酸（28.00 mg·g-1）。

在肝胰腺、肌肉和性腺組織中，抱卵前的總必需氨基酸和總非必需氨基酸含量的高低依次為肌肉>性腺>肝胰腺;抱卵前必需氨基酸含量與總氨基酸含量的比值（WEAA/WTAA）在性腺、肝胰腺和肌肉中依次為42.18、41.78和34.43，必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量的比值（WEAA/WNEAA）在性腺、肝胰腺和肌肉中依次為73.69、71.82和52.49.

3? 討論

3.1? 抱卵前和抱卵后脂肪酸含量的變動

有研究表明，甲殼動物體內用于氧化供能的脂肪酸為飽和脂肪酸（SFA）和單不飽和脂肪酸（MUFA），多不飽和脂肪酸（PUFA）一般作為功能性物質儲存在體內[20-22]。本研究中，中華絨螯蟹抱卵后肝胰腺和肌肉中的飽和脂肪酸 （SFA）和單不飽和脂肪酸（MUFA）均顯著下降，多不飽和脂肪酸（PUFA）中除C20∶5n3（EPA）和C22∶6n3（DHA）外，其余脂肪酸在抱卵后出現下降，推測可能是因為長江口中華絨螯蟹抱卵后在12月到第二年2月期間攝食強度最低[7]，導致中華絨螯蟹繁殖前期利用肝胰腺和肌肉中的脂肪氧化提供能量。此外，本研究中抱卵前后肝胰腺和肌肉中C16∶0和C18∶1n9百分量較高，這在其它甲殼動物中也存在類似情況[23， 24]，推測這兩種脂肪酸是構成甲殼動物體成分的保守脂肪酸。甲殼動物體內的長鏈多不飽和脂肪酸（PUFA）對其卵的受精率和孵化率具有重要作用[25-27]，其中C20∶5n3（EPA）與親本雌蟹的產卵量呈正相關[28-30]，C22∶6n3（DHA）與親蟹的受精率和孵化率呈正相關[31]。本研究中在肝胰腺和肌肉組織中，抱卵后多不飽和脂肪酸（PUFA）中C20∶5n3（EPA）和C22∶6n3（DHA）百分量高于抱卵前，其余多不飽和脂肪酸（PUFA）均在抱卵后中降低，推測C22∶6n3（EPA）和C22∶6n3（DHA）不是中華絨螯蟹繁殖前期優先利用的供能脂肪酸，含量的升高可能為抱卵后胚胎的孵化做準備，這與封強梅等[24]研究降海洄游的中華絨螯蟹結果一致。

3.2? 抱卵前和抱卵后氨基酸含量的變動

氨基酸是蛋白質的基本結構單位，蛋白質不僅對動物維持正常結構和功能具有重要作用，而且也作為重要的能量物質載體[32]。有研究表明，一般情況下，動物體內蛋白質含量相對穩定，當機體面臨饑餓情況時，主要利用蛋白質作為代謝能源[33]。本研究中，抱卵后肝胰腺和肌肉組織中的氨基酸含量顯著高于抱卵前，主要原因可能是當長江口餌料充足時，抱卵前組織積累的蛋白質足夠滿足繁殖前期的生理活動，因此抱卵后的氨基酸含量能夠逐漸積累;當中華絨螯蟹抱卵蟹在水中完成胚胎發育后，更傾向于利用蛋白質作為能源代謝物質[34]，因此抱卵后氨基酸含量的升高可能為抱卵蟹胚胎發育做準備。這與瓦氏黃顙魚[35]繁殖前后、太湖花?[36]繁殖前后研究結果一致。此外，本研究還發現，抱卵前后雌蟹在不同組織中必需氨基酸含量最高的是亮氨酸，非必需氨基酸含量最高的是谷氨酸，推測可能因為亮氨酸的分解產物為乙酰乙酸和乙酰CoA，由于兩者均參與脂類和糖類的代謝過程，因此高含量的亮氨酸能夠快速調配糖類、脂肪和蛋白質三大能源物質的代謝;研究表明甲殼動物分解的含氮終產物主要以氨氮形式排放，其中谷氨酸能夠與水產動物蛋白代謝物NH3結合，經谷氨酰胺酶分解成游離的NH3排出體外[37]，這可能是抱卵前后體組織谷氨酸含量高的原因之一。根據FAO/WHO的理想模型，質量較好的蛋白質其組成氨基酸WEAA/WTAA為40%左右，WEAA/WNEAA在60%以上[38]。本研究中抱卵前雌蟹和抱卵蟹必需氨基酸占總氨基酸的比值（WEAA/WTAA）在性腺、肝胰腺和肌肉中分別為49.04 mg·g-1、41.78 mg·g-1、33.16 mg·g-1、38.84 mg·g-1及39.41 mg·g-1，必須氨基酸與非必需氨基酸（WEAA/WNEAA）的比值分別為96.21 mg·g-1、96.11 mg·g-1、49.61 mg·g-1、63.50 mg·g-1及65.04 mg·g-1，只有抱卵前雌蟹性腺和肝胰腺中蛋白質含量符合FAO/WHO的理想模型，表明抱卵前的蛋白質質量高于抱卵后。

4? 結語

繁殖期不僅是中華絨螯蟹生活史中重要的階段，而且也是高耗能階段，脂肪和蛋白質是主要的能源物質載體，目前對中華絨螯蟹抱卵前后對能源物質利用研究相對較少。本研究表明，長江口中華絨螯蟹抱卵前后體組織脂肪酸和氨基酸存在差異;脂肪是中華絨螯蟹繁殖前期的主要能源代謝底物，氨基酸在抱卵后積累。建議對進行生殖放流前的中華絨螯蟹雌蟹加強脂類的營養強化。

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