動態高壓微射流輔助提取對魚鱗多糖抗氧化活性的影響

*3崔震昆王淼焱李紅波23胡梁斌23

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003;2.新鄉市水產品加工及安全風險控制重點實驗室,河南新鄉 453003;3.陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安 710021)

鯉魚被認為是健康的食品,每l00 g鯉魚肉中含蛋白質17.6 g、脂肪4.1 g、磷204 mg、鈣50 mg及多種維生素;而且鯉魚中的脂肪多為不飽和脂肪酸,具有降低人體膽固醇,防治動脈硬化、冠心病等功能[1-3]。我國是最大的鯉魚養殖國,年產量302萬噸,占世界總產量的80%。鯉魚加工過程中會產生約30%的副產物,其中魚鱗占了約5%,魚鱗通常被作為廢棄物處理,處理不當會對環境造成污染[4-5]。魚鱗中含有豐富的蛋白質、維生素、多糖和不飽和脂肪酸等,其中多糖的含量達到9.5%[6-8]。目前淡水魚磷多糖提取主要是采用堿浸提法提取[8-9],而堿法提取的廢液也會污染環境。

動態高壓微射流是一種新興的超微均質技術,通過高速撞擊、高頻振蕩、瞬時高壓和強力剪切等作用使物料破碎,起到較好的超細化和均質的作用,同時不會對活性組分造成破壞[10-11]。目前動態高壓微射流技術已廣泛應用于滅菌[12-13]、蛋白質改性[14]、多糖改性[15]及天然活性成分的提取,由于其具有降低物料粒度和增加溶劑穿透力等優點,可有效提高香菇多糖[16-17]和甘薯葉多酚[11]等的提取率。動態高壓微射流技術應用于魚鱗多糖的提取目前未見報道。將動態高壓微射流輔助提取技術應用于淡水魚魚鱗多糖的提取有望提高多糖的提取率同時降低提取過程對環境的污染。

本研究以鯉魚魚鱗為原料,研究不同壓力條件下動態高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗多糖的得率、抗氧化活性以及顆粒粒徑等的影響,為動態高壓微射流技術在天然活性多糖提取方面的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活鯉魚(重約800 g) 新鄉市某超市,魚鱗采集后于4 ℃冰箱保存備用;硫酸亞鐵、鄰苯三酚 天津科密歐試劑有限公司;水楊酸、鐵氰化鉀、過硫酸鉀 國藥集團化學試劑有限公司;DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 上海阿拉丁試劑有限公司;Tris、ABTS(2,2-azino-bis 3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid) 北京索萊寶科技有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

TOMY-SX-700全自動高壓滅菌鍋 日本Tomy公司;Centrifuge 5804R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司;HH-42水浴鍋 常州國華電器有限公司;Sartious AY-120電子精密天平 北京賽多利斯天平有限公司;高壓納米均質儀SPCH-10 英國Stansted Fluid Power公司;pH計Orion 3 STAR 美國Thermo公司;BT-9300H激光粒度分布儀 丹東佰特儀器有限公司;TU-1810型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯉魚魚鱗多糖的提取 參考熊雙麗等[9]和張露等[11]的方法進行。取新鮮的鯉魚魚鱗洗凈脫鈣后烘干粉碎,分別取6 g魚鱗粉末與200 mL蒸餾水混勻,應用動態高壓納米均質儀在50、70、90、110、130和150 MPa條件下處理3 次,每個樣品經動態高壓微射流處理后只收集中間的100 mL樣品。對照為未經動態高壓微射流處理的魚鱗粉末樣品。分別取30 mL處理后的樣品,5000 r/min離心10 min收集沉淀用于粒徑測定,剩余70 mL置于80 ℃水浴浸提3 h后離心,收集上清液用于抗氧化活性測定。

1.2.2 多糖得率測定 參考安曉萍等[18]的苯酚硫酸法進行測定。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL的葡萄糖標準溶液于10 mL具塞試管內,加蒸餾水至2.0 mL(配成了5～100 μg/mL的標準溶液),另取1支具塞試管加入2.0 mL蒸餾水作為對照。每只試管分別加入濃度為6 mg/mL的苯酚溶液1.0 mL、濃H2SO45.0 mL,混勻后放置10 min,再次震蕩均勻放置20 min,在490 nm處測定吸光度。以葡萄糖質量(X)為橫坐標,吸光度(Y)為縱坐標,繪制標準曲線并求得標準曲線方程(Y=0.4239X-0.0214,R2=0.9986)。分別取經動態高壓微射流處理后提取的樣品液2 mL,按照上述方法測定吸光度,通過標準曲線方程算得樣品液中多糖含量。

多糖得率(%)=提取液中多糖質量/原料質量×100

1.2.3 DPPH·清除能力的測定 參考Daou等[19]的方法,并略作修改。分別取2 mL 0.16 mmol/L DPPH溶液加入到2 mL不同處理組樣品溶液中,25 ℃水浴30 min,于517 nm處測定樣液吸光度(Ai)。以2 mL蒸餾水代替上述體系中2 mL樣品測定空白吸光度(A0)。以2 mL蒸餾水代替上述體系中2 mL DPPH測定本底吸光度(Aj)。Ai和Aj每個樣品做三個平行試驗,A0做三個平行。按照如下公式計算清除率并求平均值。

清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100

清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100

1.2.5 ABTS+·清除能力的測定 參考黃越等[22]的方法,略作改進。將100 mL 7 mmol/L ABTS溶液與100 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合后室溫避光靜置15 h獲得ABTS+·儲備液。用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L、pH7.4)將ABTS+·儲備液稀釋至734 nm波長處吸光度為0.70±0.02,獲得ABTS+·測定液。分別取2.0 mL ABTS+·測定液加入到不同處理組的2 mL樣品溶液中,室溫避光反應6 min,測定其在734 nm波長處的吸光度(Ai),然后將體系中的樣品用2 mL蒸餾水替代,測定其在734 nm波長處的吸光度(A0),以2 mL磷酸鹽緩沖液代替上述體系中2 mL的ABTS+·測定液測得本底吸光度(Aj)。Ai和Aj每個樣品做3個平行,A0做三個平行。計算平均清除率。

清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100

1.2.6 ·OH清除能力的測定 參考Sun等[21]的方法,略作改進。分別在10 mL比色管中加入6 mmol/L的FeSO4溶液2.0 mL、6 mmol/L的水楊酸溶液2.0 mL、6 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL和不同處理的樣品溶液2 mL混勻,37 ℃水浴30 min,測定其在510 nm處的吸光度(Ai),將體系中的樣品用2 mL蒸餾水替代,測定其在510 nm處的吸光度(A0),同時以2 mL蒸餾水代替上述體系中2 mL的H2O2測得本底吸光度(Aj)。Ai和Aj每個樣品做3個平行,A0做三個平行。計算平均清除率。

可見第二個問題，經過學生自己的觀察與思考后，不難發現這些經一條線段分開得到的兩個圖形，形狀和大小完全一樣，于是水到渠成地得到了結論：完全相等的兩個圖形，它們的周長也相等。

清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100

1.2.7 Fe3+還原力的測定 參考沈小璐等[23]的方法,略作改進。分別取2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2 mL 1%的鐵氰化鉀溶液加入到不同處理組的2 mL樣品溶液中,50 ℃水浴20 min,加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液,混合均勻,3000 r/min離心10 min,取上清液2 mL,加入2 mL蒸餾水以及0.4 mL 0.1% 三氯化鐵溶液,室溫反應10 min,測定其在700 nm處的吸光值。每個樣品做三個平行。

1.2.8 粒度的測定 分別稱取1.0 g 1.2.1中離心后得到的動態高壓微射流不同壓力處理的魚鱗粉末殘渣,用蒸餾水配成1.0 mg/mL的溶液后,采用激光粒度分布儀測定不同處理組魚鱗粉末顆粒平均粒度和粒徑分布。

1.3 數據處理

所有試驗重復3次,試驗數據處理采用SPSS 20.0軟件進行分析,試驗結果以平均值±標準差表示,顯著性分析采用Duncan檢驗,P<0.05被認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 動態高壓微射流輔助提取對總多糖得率的影響

動態高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗總多糖提取率的影響見圖1。由圖1可知,動態高壓微射流輔助提取可顯著(P<0.05)提高總多糖的得率。隨著處理壓力的升高,多糖得率逐漸升高,當處理壓力為130 MPa時,多糖得率達到7.81%。當壓力繼續升高至150 MPa時,多糖得率與130 MPa時無顯著性差異(P>0.05),本實驗結果與姜穎等[16]的研究結果類似,可能是動態高壓微射流處理中,物料因受到高速撞擊、強烈剪切和瞬時壓力釋放等作用,顆粒變得更小,增加了其與溶劑接觸的表面積,從而加快細胞內物質向溶劑中溶出的速度[17],進而提高多糖得率。當壓力過高時,氣穴和高頻振蕩的作用也增強,導致部分多糖類化合物氧化降解,多糖得率沒有進一步提高[16]。

圖1 動態超高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗多糖得率的影響Fig.1 Effect of dynamic high pressure microfluidization on extraction yield of carp scales polysaccharide注:不同小寫字母代表數據差異顯著(P<0.05);圖2～圖5同。

2.2 動態高壓微射流輔助提取對DPPH·清除能力的影響

動態高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗多糖清除DPPH·能力的影響見圖2。DPPH·是一種穩定的自由基,抗氧化劑可與DPPH·上的孤對電子配對,使其在517 nm附近的光吸收減弱或消失,因此可以通過光吸收減弱程度來判斷抗氧化劑的抗氧化能力[27]。由圖2可知,與對照組的DPPH·清除率61.77%相比,隨著處理壓力的升高,鯉魚魚鱗多糖的DPPH·清除能力也呈現遞增的趨勢,當處理壓力為110 MPa時,清除率達到最高,為86.04%,且各處理組均顯著高于空白對照組(P<0.05)。結果表明動態高壓微射流輔助提取可以有效提高鯉魚魚鱗多糖清除DPPH·自由基的能力。這與前人報道的荷葉多糖和油莎草葉總黃酮抗氧化結果一致,動態高壓微射流輔助提取可以顯著提高荷葉多糖[25]和油莎草葉總黃酮[26]的DPPH·清除能力。因為動態高壓微射流處理后,提高了多糖的提取率,而多糖可作為一種供氫物質與自由基形成穩定的物質,從而阻止了DPPH·的鏈式反應[27]。同時寇玉等研究報道荷葉多糖經動態高壓微射流處理后提取的多糖分子量更小,并確定分子量較小的多糖具有更高的抗氧化活性[25]。因此,推測隨著處理壓力的增加,動態高壓微射流提取的魚鱗多糖分子量更小,使鯉魚魚鱗多糖的抗氧化性提高。

圖2 動態高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗多糖DPPH·清除能力的影響Fig.2 Effect of dynamic high pressure microfluidization on DPPH· scavenging ability of carp scales polysaccharide

2.3 動態高壓微射流輔助提取對清除能力的影響

圖3 動態超高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗多糖清除能力的影響Fig.3 Effect of dynamic high pressure microfluidization on scavenging ability of carp scales polysaccharide

2.4 動態高壓微射流輔助提取對ABTS+·清除能力的影響

動態高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗多糖ABTS+·清除能力影響見圖4。由圖4可知,與對照組ABTS+·清除率45.86%相比,隨著處理壓力的升高,鯉魚魚鱗多糖的ABTS+·清除能力呈現遞增的趨勢,當處理壓力為150 MPa時,清除率達到最高,為89.58%,且各處理組均顯著高于空白對照組(P<0.05)。結果表明動態高壓微射流預處理可以有效提高鯉魚魚鱗多糖ABTS+·清除能力。天然活性組分的抗氧化能力與活性成分的濃度呈正相關性[28],本實驗的研究結果與涂宗財等[30]的研究結果相一致,隨著動態高壓微射流處理壓力的增高,可以顯著提高紅薯葉黃酮的抗氧化性,由于處理壓力升高導致總酚濃度提高,最終提高其抗氧化活性。

圖4 動態超高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗多糖ABTS+·清除能力的影響Fig.4 Effect of dynamic high pressure microfluidization on ABTS+· scavenging activity of carp scales polysaccharide

2.5 動態高壓微射流輔助提取對·OH清除能力的影響

動態高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗多糖清除·OH能力的影響見圖5?！H是一種重要的活性氧,具有較強的氧化能力,在生物體內可與細胞中的多種分子發生反應,從而損傷細胞[31]。由圖5可知,與對照組的·OH清除率73.31%相比,隨著處理壓力的升高,鯉魚魚鱗多糖的·OH清除能力也逐漸升高,當處理壓力為110 MPa時,清除率達到最高,為90.59%,且各處理組均顯著高于空白對照組(P<0.05)。130、150 MPa處理·OH清除率反而有所下降,可能是由于壓力過高,氣穴和高頻振蕩的作用增強,導致的氧化作用引起的。結果表明動態高壓微射流預處理可以有效提高鯉魚魚鱗多糖清除·OH的能力。本實驗結果與Huang等[32]的研究一致,動態微射流輔助提取有效提高了仙草多糖清除·OH能力。王艷敏[33]也報道了動態微射流輔助提取可以完全將玉米花粉裂解成碎片,促進多糖的溶出,最終提高玉米花粉粗多糖的抗氧化性。同時由于活性多糖分子具有還原性的半縮醛基,因此鯉魚魚鱗多糖可以是一種良好的供氫體,提供給·OH后將其還原為OH-,從而使·OH自由基被清除[20]。

圖5 動態超高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗·OH清除能力的影響Fig.5 Effect of dynamic high pressure microfluidization on ·OH scavenging activity of carp scales polysaccharide

2.6 動態高壓微射流輔助提取對Fe3+還原能力的影響

動態高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗多糖還原Fe3+能力的影響見圖6。若樣品能將Fe3+還原成Fe2+,證明樣品中含有多余電子,樣品中供給電子能力越強,抗氧化性越強[34]。由圖6可知,隨著處理壓力的升高,鯉魚魚鱗多糖對Fe3+的還原能力也不斷提高,當壓力大于110 MPa后,Fe3+的還原能力變化差異不顯著,且各處理組均顯著高于空白對照組(P<0.05)?？瞻讓φ战M吸光度僅為0.25,而經動態高壓微射流處理的樣品其吸光度最高達到0.64,吸光度越高,說明有更多的Fe2+生成。魚鱗多糖是一種良好的電子供體,所提供的電子可以使Fe3+還原為Fe2+。

圖6 動態超高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗多糖Fe3+還原能力的影響Fig.6 Effect of dynamic high pressure microfluidization on Fe3+ reducing power of carp scales polysaccharide

曹東旭等[8]研究了鯉魚魚鱗多糖的抗氧化活性,隨著濃度的增大,其吸光度達到0.5,說明濃度越高,還原能力越強。本實驗中隨著處理壓力的升高,樣品溶液中鯉魚魚鱗多糖的濃度也逐漸增加,所以可有效提高鯉魚魚鱗多糖對Fe3+還原能力。

2.7 動態高壓微射流輔助提取對物料粒度和粒徑分布的影響

動態高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗粉末的平均粒度和粒徑分布的影響見表1。由表1可知,隨著處理壓力的增加,鯉魚魚鱗粉末的平均粒度逐漸下降,當處理壓力達到150 MPa時,粒徑達到最小,平均粒度由未經處理的499.80 nm降低到192.57 nm,說明動態高壓微射流處理,可顯著(P<0.05)降低鯉魚魚鱗粉末的粒徑。由圖7可知,經過動態高壓微射流處理后,鯉魚魚鱗粉末分布集中在粒徑較小的范圍內。未經處理的鯉魚魚鱗粉末粒徑主要集中在300～1000 nm之間,而經動態高壓微射流處理后粒徑主要分布在100～500 nm之間。與其他處理組相比,130和150 MPa處理組在500～1000 nm的粒徑分布比例較高,可能是在靜電吸附和范德華力等的作用下,鯉魚魚鱗粉末顆粒重新聚集,導致部分顆粒的粒徑增加。這與前人報道的大豆膳食纖維[35]、魚骨顆粒[36]的報道結果相一致。

表1 動態高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗粉末平均粒度的影響Table 1 Effect of dynamic high pressure microfluidization on average particle size of carp scales powder

圖7 動態高壓微射流輔助提取對鯉魚魚鱗粉末粒徑分布的影響Fig.7 Effect of dynamic high pressure microfluidization on particle size distribution of carp scales powder

3 結論