貴州秋季栽培不同蕎麥品種成熟期果實中黃曲霉及其毒素的分離與鑒定

(1.貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心,貴州貴陽 550000;2.貴州省農業農村廳,貴州貴陽 555001)

蕎麥屬于雙子葉植物蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(FagopyrumMill)。在我國南北方均有分布,北方主要以甜蕎為主,南方主要以苦蕎為主[1-2]。蕎麥具有藥食同源的特性,其種子中具富含蘆丁、槲皮素和其他黃酮類化合物,具有“三降”以及抗氧化、抗炎、抗癌[3-4]等特性,被認為是一種潛在的“功能性食品”。近年來,隨著人們消費飲食理念的改變和對健康水準的提高,蕎麥以其獨特的營養成分和豐富的活性物質,受到越來越多人的青睞,需求日漸增加。但是蕎麥生產中,由于土壤、環境等影響,在加工、儲存、運輸等方式不當時,蕎麥及其相關產品可能出現發霉變質的現象,由此會影響蕎麥產品的品質,甚至不能食用。

黃曲霉(Aspergillusflavus)是子囊菌亞門的一種絲狀真菌,是曲霉屬真菌中常見的種[5]。以腐殖質等有機質為營養,普遍存在于世界各地的土壤中,并在收獲前后對眾多農作物造成嚴重污染,如玉米、花生、水稻、棉籽等[6-8]。其次生代謝產物是一組結構相關的二氫呋喃香豆素的衍生物,俗稱黃曲霉毒素(Aflatoxin),是一類劇毒類物質,其中以B1毒性最大,對人和動物的肝臟組織有嚴重損害作用,能夠引起肝臟組 織癌變導致死亡[9]。目前國內外有關黃曲霉及其毒素的報道很多,如在農業方面,由于黃曲霉毒素侵染導致全球農作物大面積污染受損,致使農作物產量和質量都受到影響,導致嚴重的經濟損失,以花生玉米尤為嚴重[10]。在食品工業方面,黃曲霉毒素污染是全世界嚴重的食品安全問題,它不僅是危害健康的潛在來源,而且還涉及農產品的腐敗。黃曲霉毒素及其動物生物轉化產物,均被稱為食源性致癌物質,對人類和動物健康產生嚴重的有害影響[11]。

蕎麥產品黃曲霉鑒定和黃曲霉毒素檢測一直是貿易出口商品的檢測和關注重點,林巧等[12]對213份涼山州苦蕎茶中的黃曲霉毒素B1(aflatoxinB1,AFB1)安全性進行評估,有150份樣品被檢測出受到不同程度AFB1的污染,檢出率為70.42%。王艷等[13]調查了6個不同地區不同類型的蕎麥食品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的污染情況,結果表明蕎麥食品受到黃曲霉毒素污染,但污染程度較輕。林巧等[14]對HPLC法定量檢測AFB1的可行性進行的系統研究,證實HPLC法用于苦蕎制品中AFB1檢測具有可行性。據陳慶富[1]報到,近年來蕎麥育種取得顯著進步,培育出來的品種除了甜蕎、常規苦蕎以外,還培育出了薄殼的米苦蕎、多年生苦蕎等新類型新品種。關于這些新類型新品種成熟種子中的黃曲霉安全性等還缺乏研究。本研究在前期檢測中發現某些米苦蕎籽粒樣品中存在B1、B2、G1、G2四種毒素,為研究其來源,以貴陽秋季栽培的2個米苦蕎、2個多苦蕎、2個甜蕎、2個常規苦蕎為材料對其成熟期成熟種子果殼和籽粒進行了黃曲霉分離鑒定,并采用HPLC法對所有品種籽粒及其分離出的黃曲霉菌株進行B1、B2、G1、G2毒素的檢測,以期為蕎麥黃曲霉毒素的來源研究和預防提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

采用DG18(氯硝胺18%甘油培養基)作為真菌培養基,參考張初署等[15]的配制方法,121 ℃滅菌25 min;無水乙醇 分析純;乙腈 色譜純;次氯酸鈉溶液 有效Cl->2.5%,分析純;石碳酸棉藍染液 上海江萊生物科技有限公司;2×EasyTaq PCR SuperMix、真菌基因組DNA提取試劑盒、黃曲霉毒素標準品 北京Sigma-Aldrich公司;通用引物ITS1、ITS4 上海生工科技有限公司。

RXZ型人工氣候培養箱 寧波江南儀器廠;DV214C萬分之一電子天平 奧豪斯國際貿易有限公司;DZS2-LCO80高溫高壓滅菌鍋 山東新華醫療器械股份有限公司;CX-41光學顯微鏡 奧林巴斯公司;BCD-525海爾雙開門冰箱 合肥美的電冰箱廠;BS-1E恒溫振蕩培養箱 國華電器有限公司;TGL-16G微型高速離心機 上海安亭科學儀器廠;CJ-1S凈化工作臺 天津市泰斯特儀器有限公司;TCT5PCR基因擴增儀 上海領成生物科技有限公司;Gel--k8500全自動凝膠成像系統 北京科創銳新生物科技有限公司;電動移液器 Eppendorf(德國);LC-DCY-12SF氮氣吹干儀 力辰科技;U3000高效液相色譜儀-熒光檢測器(配光化學衍生) Thermo scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣 此次實驗中供試蕎麥品種(見表1)于2018年8月10日秋播行播于貴州省貴陽市烏當區百宜鎮貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心百宜基地(海拔1345 m,東經106°53′,北緯26°52′),行間距33 cm,底肥使用25 kg/畝復合肥與磷肥(1∶1)混合物,播種量月2～3 kg/畝,無中耕和追肥。供試種子樣品,均是于2018年11月6日取自各供試蕎麥品種成熟期收獲前。根據五點取樣法,在種植區10×10 m的范圍內各取5個10 種子樣品清除雜質,混勻后平均分成四份,分別編號1#,2#,3#,4#,放置于4 ℃冰箱待用。

表1 供試蕎麥品種信息Table 1 Buckwheat varieties information

1.2.2 黃曲霉的分離純化 將種殼與籽粒分離,各稱取2 g。對籽粒進行表面消毒,用無菌水(3次)、70%乙醇(3 min)、次氯酸鈉(5 min)、70%乙醇(30 s)、無菌水沖洗依次進行處理消毒直至無菌[16]。種殼和籽粒(研磨成粉)均加入無菌水制成10-1濃度的懸濁液,150 r/min振蕩30 min。取出后吸取1 mL懸濁液加入9 mL無菌水制成10-2濃度懸濁液,后依次吸取1 mL稀釋成10-3、10-4、10-5濃度梯度懸濁液[17],每個稀釋度吸取200 μL涂布于DG18培養基中,每個編號的每個稀釋度重復4次,28 ℃培養7 d,每個品種方法均一致[18]。

以每個平板中真菌菌落數20～40個為宜,籽粒選取10-3為最適濃度,殼以10-4為最適濃度。對平板中各菌落進行形態、顏色、質地等觀察并計數,挑取表面長有黃綠色孢子的黃曲霉疑似菌落于空白DG18培養基中進行劃線分離純化培養7 d,對單個黃曲霉疑似菌落生長情況進行觀察。

1.2.3 分離菌落光學及掃描電鏡觀察 挑取分離純化得到的各菌株于載玻片上,滴一滴乳酸石碳酸棉藍染液,5 min后蓋上蓋玻片,吸去蓋玻片周圍多余染液,光學顯微鏡下觀察菌株頂囊、瓶梗、?；?、分生孢子、分生孢子梗等結構并拍照[19]。用膠帶輕輕粘取黃曲霉菌落的孢子及菌絲于樣品臺上,將樣品臺放置于鍍碳膜儀器中,碳鍍膜約25 min,取出后放置于掃描電鏡中進行觀察并拍照。

1.2.4 菌株基因組DNA提取、擴增與測序 取50 mg 1.2.2中純化的黃曲霉疑似菌絲于滅菌研缽中,采用試劑盒法提取菌株總DNA,以提取的DNA為模板,采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′)用于rDNA ITS區段的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增[20-21],PCR反應體系:DNA模板1 μL,2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,用ddH2O補足至總體積25 μL。反應條件為95 ℃預變性6 min,接下來的34個循環包括94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,最后一個循環在72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

回收PCR產物后交由上海生物工程有限公司測序。將結果輸入NCBI利用BLAST將培養好的不同菌系的黃曲霉菌株從DG18培養基上刮下，進行序列相似性比對。

1.2.5 菌株產黃曲霉毒素檢測分析

1.2.5.1 樣品前處理 精密稱取研磨后取樣5 g,置于50 mL離心管中,加84%乙腈溶液20 mL,震蕩浸提30 min,轉入離心機,在5000 r/min轉速下常溫離心10 min,吸取提取液10 mL于玻璃試管中,42 ℃氮吹至近干,以20 mL 10%乙腈溶液漩渦混勻20 s,置于免疫親和柱上凈化。免疫親和柱先以柱子自帶的PBS活化后,分批加入10%乙腈做溶劑的樣品溶液,控制流速在3 mL/min,待樣品過柱完成后,用20 mL屈臣氏純凈水洗滌免疫親和柱,用洗耳球吹干免疫親和柱,然后用2 mL甲醇洗脫免疫親和柱,收集流出液體,42 ℃氮吹至近干,以1 mL流動相溶解,漩渦混勻20 s,過0.22 μL尼龍濾膜至液相色譜樣品瓶中,待測。

種子剝殼后表面消毒,磨成粉后稱取5 g,之后處理方法同菌株。

1.2.5.2 色譜條件 HypersilTMBDS C18 色譜柱(4 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈/甲醇/超純水(19∶19∶62,體積比);柱溫:40 ℃;流速:1 mL/min;光化學柱后衍生,檢測波長入射:360 nm,發射:460 nm;進樣量25 μL。

1.2.5.3 標準溶液配制 配制B1:10.83、8.664、4.332、2.166、1.083 μg/L;B2:2.94、2.352、1.176、0.588、0.294 μg/L;G1:10.33、8.264、4.132、2.066、1.033 μg/L;G2:3.22、2.576、1.288、0.644、0.322 μg/L標準系列溶液,依據1.2.5.2色譜條件進行測定,以配制的黃曲霉毒素混合標準液各濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。

1.3 數據分析

采用SPSS 20.0對所得數據進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 黃曲霉菌株分離結果

將8個不同蕎麥品種的果殼和籽粒分別進行黃曲霉培養7 d后發現,所有品種果殼中均沒有出現黃曲霉菌落,黃曲霉發生率為0%;籽粒中只有米苦蕎品種出現黃曲霉菌落,其中貴米苦蕎18-1號黃曲霉發生率為1.56%,貴黑米苦蕎12號黃曲霉發生率為0.78%。結果見表2。

表2 黃曲霉菌株分離結果Table 2 Aspergillus strains isolation results

2.2 菌株形態學鑒定結果

圖1 分離菌株的形態特征圖Fig.1 Morphological characteristics of isolated strains 注:A、B分別為DG18培養基上菌落正、反圖,C為掃描電鏡分生孢子,D為掃描電鏡產孢結構,E為掃描電鏡分生孢子梗,F為光學顯微鏡產孢結構,G為光學顯微鏡產孢結構,H為光學顯微鏡分生孢子。

從8個品種蕎麥籽粒中分離獲得4株黃曲霉菌株,經仔細觀察并與黃曲霉菌株形態學特征進行比較,結果發現分離的4株黃曲霉菌株在外觀形態與生長速率上表現出高度一致,并且在光學顯微鏡下的形態也保持一致,因此從形態上看,分離的4株菌株應均屬黃曲霉菌株。

2.3 菌株分子鑒定結果

經初步鑒定后共分離四株黃曲霉菌株,從貴米苦蕎18-1號中分離出3株,分別命名為Mi18-S1、Mi18-S2、Mi18-S3,貴黑米苦蕎12號中分離出1株,命名為Heimi12-S4。凝膠電泳結果見圖2。測序后發現4株菌株ITS區段DNA序列完全一致,輸入NCBI中進行BLAST對比后發現與黃曲霉菌株ITS區段DNA序列的相似性為100%(圖3),因此可鑒定分離菌株為黃曲霉菌株。

圖2 黃曲霉菌株ITS序列擴增結果 Fig.2 ITS sequence amplification results of A.flavus注:M表示marker,圖中左側表示marker擴增帶大小;1～4分別表示黃曲霉菌株Mi18-S1、Mi18-S2、Mi18-S3、Heimi12-S4。

表3 黃曲霉菌株形態學特征Table 3 Morphological characteristics of Aspergillus flavus

圖3 鑒定菌株序列blast比對結果Fig.3 Sequence blast alignment of identified strain

2.4 黃曲霉毒素混合標準品標準曲線

在所選用色譜條件下,黃曲霉毒素得到良好的基線分離,其標準品色譜圖見圖4,黃曲霉毒素的色譜峰面積(y)為縱坐標,質量濃度(x,μg/L)為橫坐標,4種毒素在20 min內出峰,先后順序為 AFG2、AFG1、AFB2、AFB1。繪制標準曲線所得線性回歸方程如表4 所示,相應的檢測范圍內濃度與峰面積有良好的線性關系。

表4 黃曲霉毒素混合標準溶液的線性回歸方程Table 4 Linear regression equation of aflatoxin mixed standard solution

圖4 黃曲霉毒素混合標準品色譜圖Fig.4 Aflatoxin mixed standard chromatogram

2.5 黃曲霉菌株產毒量測定

米苦蕎籽粒高效液相色譜圖見圖5,只有貴米苦蕎18-1號和貴黑米苦蕎12號在相應時間內出峰,并且4種毒素均有。

圖5 貴米苦蕎18-1號(A)和貴黑米苦蕎12號(B)籽粒中黃曲霉素高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatography in rice grains of Guimiku 18-1 and Guiheimi 12

各樣品籽粒中產生黃曲霉毒素及含量見表5。由表5可知,不同品種籽粒間產毒能力有顯著差異,貴米苦蕎18-1號中AFB1產毒量為(5.861±0.055) μg/kg、AFB2為(1.605±0.052) μg/kg、AFG1為(3.846±0.476) μg/kg、AFG2為(1.754±0.143) μg/kg,AFT總量為(12.625±1.941) μg/kg。貴黑米苦蕎12號中AFB1產毒量為(14.475±0.533) μg/kg、AFB2為(3.463±0.063) μg/kg、AFG1為(9.111±1.636) μg/kg、AFG2為(3.393±0.151) μg/kg,AFT總量為(30.442±1.474) μg/kg。

表5 不同蕎麥品種籽粒中的黃曲霉毒素含量(μg/kg)Table 5 Aflatoxin content(μg/kg)in rice grains of different buckwheat varieties(μg/kg)

分離黃曲霉菌株產毒種類及含量見表6。由表6可知,各菌株均產AFB1、AFB2、AFG1、AFG2,和籽粒中結果一致,且不同菌株之間差異顯著。

表6 黃曲霉菌株產黃曲霉毒素含量(μg/kg)Table 6 Contents of aflatoxin(μg/kg)produced by Aspergillus flavus strains(μg/kg)

3 結論與討論

本研究利用蕎麥中的米苦蕎、多年生苦蕎、甜蕎和常規苦蕎等8個品系的材料,首次對成熟期成熟果實果殼和籽粒進行了黃曲霉菌株的分離與鑒定及毒素研究。結果顯示所有蕎麥果殼上均未分離到黃曲霉菌株,而籽粒中僅從米苦蕎品種分離出并發現成熟期少數種子中含有黃曲霉毒素。由于供試蕎麥中除米苦蕎以外的蕎麥品種都具有厚的果殼,可對籽粒有一定保護作用。本研究中多苦蕎、甜蕎、常規厚殼苦蕎這3類蕎麥品種相對于米苦蕎類型而言不容易被黃曲霉感染,并不表示這3類蕎麥品種不被黃曲霉感染,其未檢出黃曲霉的原因可能是由于果殼厚、保護完整,或者取樣樣本隨機的原因。推測供試米苦蕎帶菌帶毒的可能原因是果實果殼常常開裂暴露部分米粒、易被蟲食形成損傷,導致少數籽粒遭遇黃曲霉菌感染而帶菌和帶毒。因此在米苦蕎生產上需要更加嚴格監測控制,特別是80%以上果實成熟時就要及時收獲干燥和良好保存,同時在育種上需要選育不開裂薄殼苦蕎品種,以減少黃曲霉感染。

本研究結果表明不同蕎麥品種帶菌產毒多少存在差異,Chitarrini等[22]用產生AFB1的黃曲霉菌株NRRL 3357接種于F.tataricum(var.Golden)和F.esculentum(var.Aelita)兩種蕎麥品種的瘦果中,以分析它們在瘦果感染期間產毒素的能力。結果表明,F.tataricum的瘦果對F.flavus感染敏感較低,產毒較少,說明了蕎麥籽粒中黃曲霉產毒量多少和種子自身有很大關系,不同品種之間存在顯著差異。本研究只有米苦蕎產毒,其他品種不產,并且米苦蕎的兩個樣品產毒量也存在差異,因此這種品種間帶菌產毒的差異為今后抗黃曲霉蕎麥品種的選育提供幫助。

本研究發現籽粒中產毒量遠大于從籽粒中分離菌株的產毒量,據Ramon等[23]的報道,得克薩斯州商品棉籽中黃曲霉毒素所占百分比會隨著時間的增加而增加,污染情況也變得嚴重。本研究中毒素在籽粒中積累時間較菌株中長,所以毒素積累多。因此需按時收獲成熟蕎麥,收獲過晚可能會導致蕎麥籽粒中黃曲霉污染增加。

本研究結果顯示蕎麥中不同黃曲霉菌株產毒量存在顯著差異,如Heimi12-S4總產毒量為(1.794±0.024) μg/kg,而Mi18-S1總產毒量為(11.102±0.095) μg/kg。因此在今后蕎麥種植過程中,可以依據菌株間產毒差異性從而篩選出黃曲霉毒素生物防控菌株和不產毒菌株,深入探索抑制黃曲霉生長及黃曲霉毒素產生的作用機制,為蕎麥中黃曲霉毒素的防控提供更準確更全面的信息。