超聲波輔助酶法制備北芪菇抽提物及其抗氧化能力研究

秦 楠,郭麗麗,王小敏,孫 健,李杰玉,張芹仙,李冠文,劉 星

(山西中醫藥大學中藥與食品工程學院,山西太原 030619)

北芪菇是一種新型功能食用菌,產自山西省渾源縣,結合其74 km2富硒地區的地理資源優勢,在平菇中添加黃芪(亦稱“北芪”)培育而成。除具有平菇普通營養、功能成分以外,氨基酸、多糖、總黃酮含量顯著高于平菇,尤其硒含量較普通平菇提高15%[1]。在抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、改善心腦血管疾病、調節免疫,促進胃腸運動、助消化等方面表現出良好的藥理作用[2-3]。其中,多糖、黃酮類物質具有優良的抗氧化活性,能夠有效緩解氧化壓力,對疾病預防和治療有一定的意義[4-5]。

目前,關于北芪菇抽提物及其黃酮類物質的研究還未見報道,其中粗多糖研究報道亦相對較少。邵偉等[6]利用雙孢菇菇柄和殘次菇為原料,在40 ℃、pH7.0和1.0% NaCl的條件下經菇體自溶,獲得雙孢蘑菇抽提物,總氮含量達到6.4 g/100 g，氨基酸態氮可達3.1 g/100 g。曹春蕾等[7]對3種木層孔菌的不同溶劑提取物進行了體外抗氧化活性研究,結果表明不同溶劑提取物都具有清除DPPH自由基、羥自由基的能力?？姵少F等[8]對雙孢蘑菇總黃酮抗油脂氧化研究發現,抗氧化性隨總黃酮含量增加而提高。

本實驗探討了以纖維素酶酶解北芪菇制備抽提物的工藝條件,并對該抽提物進行了體外抗氧化試驗，旨在開發一種集營養、調味及保健于一體的天然物質,可用于復合調味品調配、高品質醬油生產等,作為一種理想的食品添加劑在食品中廣泛應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北芪菇 山西大同渾源縣;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 美國Sigma公司;硫酸亞鐵、水楊酸、H2O2、稀鹽酸、甲醛、乙醇、氫氧化鈉、纖維素酶(均為分析純) 天津市科密歐化學試劑有限公司；試驗用水 蒸餾水。

SB-5200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公;DS-1高速組織搗碎機 江蘇省金壇市友聯儀器研究所;TGL-20B離心機 上海安亭科學儀器廠;TP310酸度計 北京時代新維測控設備有限公司;0-32手持型折光儀 上海勃基儀器儀表有限公司:HH-1恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;HS-12磁力攪拌器 北京金紫光儀器儀表公司;AR323CN電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 北芪菇抽提物制備工藝 將新鮮北芪菇切碎成丁,經過高速組織搗碎機組織勻漿,按一定的水料比混勻,加入一定量纖維素酶,調整pH后放入超聲波提取器中提取50 min。95 ℃水浴保溫10 min方式滅酶,在4 ℃下5000 r/min離心15 min,取上清液,冷凍干燥,即得北芪菇抽提物。

1.2.2 北芪菇抽提物制備單因素實驗 本試驗選擇水料比、超聲時間、超聲溫度、酶用量、pH進行單因素實驗,以氨基態氮含量和可溶性固形物含量為指標,不同因子梯度條件見表1。

表1 單因素水平設計表Table 1 Horizontal design of single factor

1.2.3 響應曲面法試驗設計 基于單因素實驗結果,選用中心組合試驗Box-Behnken設計方案,選取酶用量、超聲時間和水料比三個變量,以A、B、C來表示,并以1、0、-1分別代表其變量的水平,按方程x=(X-X0)/ΔX對自變量進行編碼,其中,x 表示變量的編碼值,X表示變量的真實值,X0表示試驗中心點變量的真實值,ΔX表示變量的步長變化,氨基態氮含量Y表示響應值,見表2。

表2 中心組合試驗Box-Behnken設計因素和水平編碼值Table 2 Independent variables and levels in Box-Behnken

1.2.4 氨基態氮含量和可溶性固形物含量的測定 氨基態氮測定:甲醛滴定法[9];可溶性固形物含量測定:手持式折光儀[10]。

1.2.5 黃酮含量的測定 精密稱量10 mg蘆丁于50 mL容量瓶中,用60%的乙醇溶解至刻度,得到濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液。分別量取1、2、3、4、5 mL的蘆丁標準溶液于25 mL的容量瓶中,加入60%乙醇5 mL,精密加5%亞硝酸鈉溶液5 mL,放置6 min,加入10%的硝酸鋁0.5 mL,放置6 min,加入4%的氫氧化鈉5 mL,用60%的乙醇定容,室溫放置6 min,于510 nm處測定吸光度。

以濃度C(μg/mL)為橫坐標,吸光度A為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。精密稱取北芪菇酶法抽提物1.0 g稀釋102倍,準確吸取稀釋后樣品溶液5 mL置于25 mL的容量瓶中,按照上述方法測定吸光度,重復三次,計算北芪菇酶法抽提物中黃酮的含量[11-12]。Y=0.043x+0.0554，R2=0.9993。

1.2.6 抗氧化活性的測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測定 分別吸取2 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液和1 mL質量濃度分別為200、300、400、500、600 mg/mL北芪菇抽提物液于比色管中,混勻,避光靜置30 min,于517 nm處測定吸光度A樣,用1 mL蒸餾水代替樣液測定其吸光度值A空白,以VC作為陽性對照[13]。樣品對DPPH的清除率為:DPPH清除率(%)=(A空白-A樣)/A空白×100。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除率的測定 ABTS自由基的制備:將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合(1∶0.5,V/V),置室溫黑暗條件下放置12～16 h后備用,使用前用無水乙醇稀釋至吸光度在734 nm處為0.7±0.02[14]。在同一具塞試管中加入3 mL的ABTS自由基溶液和150 μL北芪菇抽提物,避光反應6 min后于734 nm處測定其吸光度值A樣,用無水乙醇代替樣品測定A空白。以VC作為陽性對照。

ABTS+·的清除率(%)=(A空-A樣)/A空白×100

1.3 數據分析

所有試驗數據均使用GraphPad Prism 5和Design-Expert 8.0.6統計軟件進行數據處理,運用最小差異顯著法(LSD)進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 抽提物工藝單因素實驗結果

2.1.1 水料比對制取北芪菇抽提物的影響 由圖1可知,隨著水料比增大,氨基態氮與固形物含量呈現先升高后下降的趨勢,當水料比為10∶1 mL/g時,氨基態氮與固形物含量均達到最大值,水料比對其影響極顯著(P<0.01)。當水料比大于10∶1,兩者含量明顯降低,可能是由于水量增大致使菇水混合液變稀,溶出物減少,進而使氨基態氮收率降低,且固形物含量減少[17]。故選取水料比10∶1 mL/g為宜。

圖1 水料比對北芪菇抽提物的影響Fig.1 Effect of ratio of water to material on Astragali mushroom extracts

2.1.2 酶用量對北芪菇抽提物的影響 由圖2可知,隨酶用量增大,北芪菇抽提物氨基態氮與固形物含量均呈現先增加后減少的趨勢。酶用量為0.5%時氨基態氮含量達到最高值,然后含量降低;可溶性固形物含量在酶用量為0.3%時達到最高值,然后緩慢減少,酶用量對其影響極顯著(P<0.01)。這是由于隨著酶用量的增加,酶與底物接觸機會增大,導致內容物從細胞中分離出來使氨基態氮收率與固形物含量上升。而當酶量添加到一定程度時內容物已完全溶出,過量的酶無貢獻反而會導致內容物降解致使收率減少,固形物含量下降[18-19]。綜合考慮,故選取酶用量0.5%為宜。

圖2 酶用量對北芪菇抽提物的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on Astragali mushroom extracts

2.1.3 超聲時間對北芪菇抽提物的影響 由圖3可知,隨著超聲時間的延長,北芪菇抽提物氨基態氮與固形物含量呈先升高后降低趨勢。40 min時氨基態氮與固形物含量均達到了最大值,當大于40 min后含量都逐漸降低,酶用量對其影響極顯著(P<0.01)。由于超聲時間越長空化效應越強,氨基態氮損失較大導致收率降低,固形物含量減少[20]。故選取超聲時間40 min為宜。

圖3 超聲時間對制取北芪菇抽提物的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on Astragali mushroom extract

2.1.4 超聲溫度對北芪菇抽提物的影響 由圖4可知,隨著超聲溫度的提高,北芪菇抽提物氨基態氮與固形物含量呈均現出先增大后降低的趨勢,40 ℃時氨基態氮與固形物含量都達到最高值。這是由于溫度對纖維素酶與內源酶系有較大影響,溫度過高會破壞酶活性,導致蛋白質等物質分解不徹底,內容物析出減少,因此造成氨基態氮收率與固形物含量下降[21]。故選取超聲溫度40 ℃。

圖4 超聲溫度對芪菇抽提物的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on Astragali mushroom extracts

2.1.5 pH對制取北芪菇抽提物的影響 由圖5可知,隨著pH提高,北芪菇抽提物氨基態氮與固形物含量呈均現出先增大后減小的趨勢。pH4時氨基態氮與固形物含量都達到最大值。由于pH影響外源酶與內源酶系的活力,pH過高使酶活受限,導致北芪菇子實體分解不徹底,且內容物析出量降低,因此氨基態氮收率與固形物含量呈下降趨勢[22]。故選取pH為4為宜。

圖5 pH對制取北芪菇抽提物的影響Fig.5 Effect of pH value on Astragali mushroom extract

2.2 響應面法分析

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表5的試驗數據進行過多元回歸擬合,獲得氨基態氮含量(Y),酶用量(A)、超聲時間(B)和水料比(C)的二次多項回歸模型為:

Y=0.72+0.036A+0.0058B-0.05C+0.0002AB-0.99AC-0.013BC-0.14A2-0.18B2-0.23C2

從方差分析表4中可知,模型F值為47.60,P值為P<0.0001,達到極顯著水平,失擬項P=0.0629>0.05不顯著,表明該模型與試驗擬合程度高,模型精度高,試驗誤差小,能夠用此回歸方程推測抽提物工藝條件對氨基態氮含量的影響?；貧w方程系數顯著性檢驗結果:水料比(C)的一次項及二次項對響應值的影響極顯著(P<0.01),超聲時間(B)的二次項極顯著(P<0.01),酶用量(A)的一次項顯著(P<0.05),二次項極顯著(P<0.01),超聲時間(B)一次項及交互項均不顯著。由F值得出試驗各因素影響抽提物中氨基態氮含量的主次順序為水料比(C)>酶用量(A)>超聲時間(B)。

表3 響應面設計方案及試驗結果Table 3 Design and test results of response surface

表4 二次回歸模型的方差分析結果Table 4 Analysis of variance for each item of developed quadratic regression model

根據模型方程繪制響應面圖,分別見圖6。其中每個響應面分別代表兩個變量在恒定值(取零水平值)下,另外兩個獨立變量之間的相互作用。

圖6 兩因素交互作用對氨基態氮含量的影響Fig.6 Interactive effects of extraction parameters on the amino nitrogen content

由圖6a所示,當水料比處在中心點時,酶用量在0.3%～0.7%范圍內,隨著超聲時間的延長,氨基態氮含量先升高,當用量達到0.5%后,氨基態氮含量緩慢下降。同樣當超聲時間在30～50 min范圍內,氨基態氮含量先升高,達到最大值后再緩慢下降。由圖6b所示,當超聲時間處在中心點時,酶用量在0.3%～0.7%范圍內,隨著水料比的增大,氨基態氮含量先顯著升高,達到最大值后再逐漸下降。同樣當水料比在5∶1～15∶1 mL/g范圍內,隨著酶用量增加,氨基態氮含量先急劇增大,達到最大值后陡然下降。由圖6c所示,當酶用量處在中心點時,超聲時間在30～50 min范圍內,隨著水料比的增大,氨基態氮含量先緩慢升高,達到最大值后再逐漸下降。同樣當水料比在5∶1～15∶1 mL/g范圍內,隨著超聲時間的延長,氨基態氮含量陡然升高,達到最大值后再急劇下降。

2.2.2 驗證試驗 由Design-Expert軟件分析得出北芪菇抽提物制取的最佳條件是:酶用量0.52%、超聲時間40 min、水料比12.37∶1 mL/g,理論最佳氨基態氮含量為0.760 mg/mL,黃酮含量6.5%±0.25%?？紤]到實際操作的方便性,將北芪菇抽提物的制取條件修正為酶用量0.5%、水料比12∶1 mL/g、超聲時間40 min、超聲溫度40 ℃、pH4。在上述條件下設置三個重復進行驗證試驗,平均值為(0.765±0.12) mg/mL,與預測值擬合度良好,無顯著性差異(P>0.05),表明試驗確定的模型條件可以用于預測實際值,此方程有效可靠。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率 如圖7所示,隨著抽提物質量濃度的增大,清除DPPH自由基的能力呈現正相關。當質量濃度為200～400 μg/mL范圍內,對DPPH自由基的清除率緩慢增大。當質量濃度大于400 μg/mL時,清除率顯著增高,當達到600 μg/mL時,與同質量濃度的VC標準品相比,清除DPPH自由基的能力高于對照。通過方差分析表明,各質量濃度間對DPPH自由基的清除能力的差異顯著,在一定質量濃度范圍內抽提物與清除能力表現出劑量(質量濃度)-效應關系。

圖7 不同濃度抽提物對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of extracts with different concentrations on DPPH free radical

2.3.2 ABTS+自由基清除率 如圖8所示,抽提物對ABTS+自由基的清除能力隨質量濃度的增大呈現增大趨勢。當質量濃度為200～300 μg/mL時,清除率增幅顯著(P<0.05),在300～600 μg/mL時,清除率依然增大,但趨勢較平穩,與同質量濃度的VC標準品相比,清除ABTS+自由基的能力低于對照。

圖8 不同濃度抽提物對ABTS+自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of extracts with different concentrations on ABTS+ free radical

2.3.3 ·OH清除率 如圖9所示,在抽提物質量濃度200～600 mg/mL范圍內服從線性分布,抽提物對羥自由基清除率隨著其質量濃度的增加而增大,說明抽提物對羥自由基清除力的大小與其質量濃度呈現正相關。與同質量濃度的VC標準品相比,抽提物清除羥自由基能力相對較弱。

圖9 不同濃度抽提物對羥自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of extracts with different concentrations on ·OH

3 結論與討論

北芪菇抽提物富含多種營養與功能成分,結合前期抽提物功能成分測定的結果,對于調節免疫、降血糖或降血脂等其他保健功效有待于進一步研究。