響應面法優化酶法提取亞麻蛋白工藝

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(1.河北北方學院食品科學系,河北張家口 075000)(2.河北省農產品食品質量安全分析檢測重點實驗室,河北張家口 075000)(3.張家口市食品藥品檢測中心,河北張家口 075000)

亞麻(Linumusitatissimum)別名為胡麻,是亞麻科、亞麻屬一年生草本植物,主要分布在俄羅斯、加拿大、中國、印度和哈薩克斯坦等國家[1-2]。亞麻籽(flaxseed或linseed)即亞麻的種子,為紅棕色果實,表面平滑有光澤,有極強的堅果風味[3]。亞麻籽含有蛋白質、油脂、木質素和亞麻膠等成分,其中脂肪含量為30%～40%,含有飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和大量的多不飽和脂肪酸;其中蛋白質含量為21.9%～38.6%,必需氨基酸種類齊全且評分較高,含有很高的營養價值;加工性能良好,可應用在食品中[4-7]。

目前我國油用亞麻產業比較薄弱,產品僅限于亞麻油,榨油之后的剩余物餅粕一般作為動物飼料,導致較高營養價值的植物性蛋白質資源沒有得到有效的利用,阻礙了亞麻蛋白資源的開發以及在食品工業中的應用[8-12]?，F在全球面臨糧食危機,充分利用糧油加工副產物,挖掘亞麻籽餅粕的資源潛力,不僅可以增加糧食來源,還可以開發出新的食品資源,增加企業的經濟效益,促進農民增收,推動農業產業化的發展[13-15]。

亞麻蛋白的提取方法有堿溶酸沉法,但是在較高的堿性環境下會破壞蛋白質的營養特性,并加深產品色澤[16]。近幾年來開始用酶法提取蛋白質,具有反應條件溫和、時間短、提取率高,能更多的保留蛋白質的營養功能等優點[17-18]。張慧君等[19]采用復合酶水解技術結合堿溶酸沉的方法從亞麻餅粕中提取亞麻蛋白,通過單因素和響應面試驗對pH、時間、料液比、溫度進行優化,最終的提取率達64.26%。

酶法提取蛋白質反應條件溫和,能夠避免堿溶酸沉法對蛋白質帶來的負面影響。且能夠更多的保留蛋白質的營養價值,所以本試驗采用酶法亞麻籽餅粕中的亞麻蛋白。以榨油后的亞麻籽餅粕為原料,先進行脫脂、脫膠處理,然后在果膠酶、纖維素酶、植酸酶、α-淀粉酶各自最適的條件下進行篩選,以亞麻蛋白提取率為考察指標,選擇提取率較高的酶。通過單因素試驗和響應面法優化得到酶法提取亞麻蛋白的工藝條件,探討加酶量、溫度、浸提pH和時間4個因素對亞麻籽蛋白提取率的影響,確定最佳的工藝參數,為亞麻籽蛋白的進一步開發提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞麻籽餅粕 來自康保明光糧油有限公司,外觀整齊,無霉變;果膠酶(500 U/mg)、植酸酶(5 U/mg)、纖維素酶(50 U/mg) 上海赫鵬新生物科技有限公司;α-淀粉酶(≥3700 U/g) 北京奧博星生物技術有限公司;考馬斯亮藍-G250 北京亞米生物科技有限公司;牛血清蛋白 北京博爾西科技有限公司;石油醚、正己烷 天津市科密歐化學試劑有限公司;氫氧化鈉 天津市永大化學試劑有限公司;無水乙醇 天津市風船化學試劑科技有限公司;鹽酸 北京化工廠。

PHS-3C酸度計 上海佑科儀表有限公司;HC-3018高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;79-1磁力加熱攪拌器 常州澳華儀器有限公司;DS-T300高速多功能粉碎機 上海市頂帥工貿有限公司;UV76紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;HH-S數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠;HY-4A調速振蕩器 常州澳華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫膠、脫脂亞麻籽餅粕的制備 參照張澤生等[20]的做法并稍作修改,亞麻籽餅粕粉碎過篩(80目),加入20倍的蒸餾水、溫度為75 ℃,提取時間為90 min,洗膠次數為3次,進行脫膠。烘干亞麻籽餅粕加入30倍的正己烷,振蕩6 h,回收正己烷,餅粕于通風櫥晾12 h即為脫脂亞麻籽餅粕。

1.2.2 基本成分的測定 亞麻籽餅粕中脂肪的測定:根據《GB/T 5009.6-2016 食品中脂肪的測定》中第一法索氏抽提法測定;水分的測定:根據GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》中第一法直接干燥法測定;粗蛋白的測定:根據GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》中的第一法凱氏定氮法測定;灰分的測定:根據GB 5009.4-2016《食品中灰分的測定》中的第一法食品中總灰分的測定來測定;淀粉的測定:根據GB 5009.9-2016《食品中淀粉的測定》中的第二法酸水解法測定;纖維素的測定:根據GB/T 5515-2008《糧食中粗纖維素含量測定》中的介質過濾法測定。

1.2.3 亞麻蛋白提取工藝 稱取1 g脫膠、脫脂亞麻籽餅粕粉,加15 mL 蒸餾水及酶,調pH至6,60 ℃水浴振蕩3 h,100 ℃滅酶,4000 r/min離心15 min,考馬斯亮藍法測定上清液中的蛋白質含量(清蛋白);收集沉淀物,加入15 mL 0.5%的NaCl溶液,振蕩30 min,4000 r/min離心15 min,收集上清液測定蛋白質含量(球蛋白);收集沉淀物,加入15 mL 70%的乙醇,振蕩30 min,4000 r/min離心15 min,收集上清液測定蛋白質含量(醇溶蛋白);收集沉淀物,加入15 mL 0.2%的NaOH,振蕩30 min,4000 r/min離心15 min,收集上清液測定蛋白質含量(球蛋白)。然后將清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和球蛋白的含量加起來即為提取亞麻蛋白的含量。

1.2.4 最佳糖化酶的篩選 選α-淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶這四種糖酶水解亞麻蛋白,條件見表1,使酶活力達到2000 U/g,按各自最適合的條件下水解4 h,以亞麻蛋白的提取率為指標,篩選出最適合亞麻籽餅粕酶解的糖酶。

表1 各種酶的反應條件Table 1 Reaction conditions of various enzymes

1.2.5 單因素試驗 根據1.2.4的篩選蛋白質提取率最高的一種酶,對酶的添加量、亞麻蛋白的提取溫度、亞麻蛋白的浸提pH、亞麻蛋白的提取時間四個因素進行單因素實驗。

1.2.5.1 加酶量對提取率的影響 稱取亞麻籽餅粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸餾水,分別按原料的1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%加入α-淀粉酶,在55 ℃下調節亞麻籽餅粕反應體系的pH為6,設定提取時間為3.5 h,確定適宜的添加劑量。

1.2.5.2 提取溫度對提取率的影響 稱取亞麻籽餅粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸餾水,按原料的2%加α-淀粉酶,分別在50、55、60、65、70、75 ℃下調節亞麻籽餅粕反應體系的pH為6.00,提取時間為3.5 h的情況下來選出最適的提取亞麻蛋白的溫度。

1.2.5.3 pH對提取率的影響 稱取亞麻籽餅粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸餾水,按原料的2%加α-淀粉酶,在55 ℃下分別調節亞麻籽餅粕反應體系的pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,設定時間為3.5 h的情況下來選出最適的提取亞麻蛋白的溫度。

1.2.5.4 提取時間對提取率的影響 稱取亞麻籽餅粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸餾水,按原料的2%加α-淀粉酶,在55 ℃下調節亞麻籽餅粕反應體系的pH為6,設定時間為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h的情況下來選出最適的提取亞麻蛋白的溫度。

1.2.6 響應面試驗 在單因素試驗基礎上,以加酶量(A)、提取溫度(B)、提取pH(C)、提取時間(D)為因素,亞麻蛋白提取率(Y)為響應值,利用Design Expert 8.06軟件,進行響應面的試驗設計。響應面試驗設計因素與水平見表2。

表2 響應面設計實驗因素與水平Table 2 Experimental factors and levels of response surface design

1.2.7 亞麻蛋白提取率的測定和計算 亞麻籽餅粕中蛋白質含量采用凱氏定氮法測定。

提取蛋白質含量采用SN/T3926-2014《出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質含量的測定》—考馬斯亮藍法[21],并用牛血清白蛋白(BSA)作為標準品繪制標準曲線,測得蛋白的標準曲線為y=0.6177x-0.0063,R2=0.9933。

蛋白質提取率(%)=提取蛋白含量(g)/亞麻籽餅粕中蛋白質含量(g)×100

1.3 數據處理

數據處理采用Design Expert 8.06軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 亞麻籽餅粕基本成分的測定結果

隨著人們生活水平的日益上升,人們對蛋白質的要求更高,因此不僅要開發新的蛋白質資源,還要加強對蛋白質功能性質的研究。大米的蛋白質含量約為8%,玉米的蛋白含量約為10%,高梁、燕麥等作物的蛋白質含量約在12%左右,谷糠蛋白含量在13%左右[22],而亞麻餅粕中蛋白質含量高達30.67%,且在我國一般作為動物的飼料或者是直接丟棄,所以說亞麻餅粕中的蛋白質具有一定的開發意義，其可作為優質蛋白質的來源[23]。

表3 亞麻籽餅粕基本成分Table 3 Basic components of flaxseed meal

2.2 篩選最佳酶制劑

如圖1所示,亞麻蛋白的提取率從大到小表現為:α-淀粉酶(61.52%)>纖維素酶(56.63%)>植酸酶(55.26%)>果膠酶(47.46%)。因此選擇α-淀粉酶做為提取酶制劑。因為各種酶作用底物不同,淀粉酶水解底物為淀粉,果膠酶水解底物為果膠,纖維素酶水解底物為纖維素,植酸酶水解底物為植酸,各種糖酶的活力不一。因此為保證酶的充分作用,將酶的添加量統一按酶底比添加。雖然淀粉酶的活性最低,但是它的作用效果最好,提取率最高。

圖1 最佳糖酶篩選結果Fig.1 The best screening results of glycose

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 加酶量對蛋白質提取率的影響 由圖2可知,當加酶量從1.0%增加至2.5%時,亞麻蛋白的提取率呈現快速上升趨勢;當加酶量從2.5%增加至3.5%時,亞麻蛋白提取率呈平緩趨勢。說明當α-淀粉酶的添加量較少時,α-淀粉酶能夠與底物充分結合,當加酶量大于2.5%時,底物濃度過低,提取率不再上升。一般來講,加酶量越高提取成本越大,因此加酶量采用2.5%為宜。

圖2 加酶量對蛋白質提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on protein extraction rate

2.3.2 提取溫度對蛋白質提取率的影響 由圖3可知,當溫度從50 ℃增加到60 ℃時,隨著提取溫度的不斷升高,亞麻蛋白提取率呈現上升趨勢;提取溫度從60 ℃增加到75 ℃時,亞麻蛋白的提取率呈下降趨勢,這可能與溫度升高后蛋白質變性有關。所以選擇60 ℃作為亞麻蛋白的提取溫度。

圖3 提取溫度對蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on protein extraction rate

2.3.3 pH對蛋白質提取率的影響 由圖4可知亞麻蛋白提取率在pH5.0～7.5范圍內的變化情況。pH的變化會影響帶電性,的帶電性直接影響蛋白質-蛋白質、蛋白質-溶液的相互作用,從而影響蛋白質的溶解性,最終影響蛋白質的提取率[24]。在試驗pH范圍內,當pH從5.0增至6.5時,隨著pH的增加,亞麻蛋白的提取率呈現上升的趨勢;當pH從6.5增至7.5時,隨著pH的增加,亞麻蛋白的提取率呈現下降的趨勢,因此較適宜pH為6.5。

圖4 pH對蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of pH on protein extraction rate

2.3.4 提取時間對蛋白質提取率的影響 由圖5可知2.0～4.5 h內亞麻蛋白提取率的變化情況。當提取時間從2.0 h增至3.5 h時,隨著提取時間的延長,亞麻蛋白提率呈現上升的趨勢;當時間從3.5 h增至4.5 h時,隨著提取時間的延長,亞麻蛋白提取率趨于平緩,不再上升。從經濟方面來考慮,較合適的時間選為3.5 h。

圖5 提取時間對蛋白質提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on protein extraction rate

2.4 響應面對提取試驗的優化

2.4.1 響應面試驗設計及結果 在通過單因素獲得最佳條件后,接著用Design-Expert.V8.0軟件中的Box-Benhnken進行設計,以加酶量、提取溫度、pH和提取時間為變量,以提取率為響應值進行分析,設計結果見表4。

表4 方案設計及響應面法試驗結果Table 4 Scheme design and results of response surface method test

對表4中的數據用響應面軟件進行方差分析,得到Y對A、B、C和D的二次多項回歸模為:Y(%)=66.71+0.74A+0.30B+0.71C+1.52D-0.078AB-2.43AC+0.14AD-0.54BC+0.31BD+0.085CD-7.51A2-1.60B2-0.69C2-7.63D2,由表5可知,回歸模型的P<0.0001,表現為極顯著,失擬項P>0.05,表現為不顯著,R2=0.9045>0.9,表明模型復合本次試驗的結果,所以可以用此模型分析和預測提取亞麻籽餅粕中亞麻蛋白工藝的優化。

表5 實驗結果的方差及顯著性分析Table 5 Variance and significance analysis of the expeimental results

2.4.2 各因素交互影響分析 由圖6可知,在α-淀粉酶提取亞麻籽餅粕中蛋白的工藝中,亞麻蛋白提取率隨著各因素的增大而逐漸增,當亞麻蛋白提取率增至極值后,隨著各因素的增大,提取率則逐漸減小。響應面的值影響越大的因素,那么該曲面就會越陡,各因素彼此之間交互影響的強弱大小是通過等高線的形狀來反映的。用圓形和橢圓形分別來表示影響因素相互作用的不顯著性和顯著性[25]。影響亞麻蛋白提取率的主次順序為:D>A>C>B。當酶的添加量一定時,提取溫度變化對提取率影響不明顯;當酶添加量不變時,亞麻蛋白提取率在4 h前增加,4 h后降低。當提取時間固定時,當添加的酶量約為2.5%時,亞麻蛋白的提取率最優。若添加的酶的量大于約2.5%,提取率不會發生顯著變化。當pH一定時,隨著提取時間的增長,提取率是不斷上升的,當提取時間一定時,亞麻蛋白質的提取率隨提取pH的增長無明顯變化。

圖6 各因素交互作用對影響的響應面及等高線Fig.6 Response flour and contour lines of interaction of various factors to influence

2.4.3 驗證試驗 響應面優化試驗預測的最佳提取條件為:加酶量2.52%、溫度60 ℃、pH6.04、時間4.06。理論值提取率為65.54%。為了檢測模型的準確性,對最佳工藝條件進行驗證?？紤]到操作實際性,將條件進行修正,加酶量2.5%,溫度60 ℃,pH6,時間4 h,進行三次試驗取平均值,得到實際的亞麻蛋白的提取率為接近略低于理論值為64.15%,與預測值的相對誤差是2.1%。說明建立的模型和實際情況比較符合。

3 結論

在單因素的基礎上,利用響應面試驗研究4個因素對亞麻蛋白提取率的影響,優化亞麻蛋白的提取工藝條件,根據響應面試驗建立的二次多項式模型具有良好的顯著性。α-淀粉酶提取亞麻籽餅粕中亞麻蛋白的最理想工藝條件為:α-淀粉酶用量2.5%,溫度60 ℃,pH6,時間4 h,亞麻蛋白提取率為64.15%。同時,根據響應面分析,各影響因素對蛋白質提取率的作用大小依次為:提取時間>加酶量>pH>提取溫度。雖然本文的提取率與張慧君等[19]得到的提取率相差不大,但是她的試驗方法結合了堿溶酸沉法,據報道堿溶酸沉法對蛋白質的功能性質不利[26],酶法則能夠更好的保留蛋白質的功能性質。用α-淀粉酶對亞麻籽餅粕進行脫膠、脫脂的預處理之后,再來提取亞麻蛋白質,為亞麻蛋白資源的進一步開發提供基礎理論研究技術。