氣相色譜檢測啤酒中十六種有機磷農藥殘留方法的建立

柴宗龍,錢瀅文,袁彩霞,洪 霞,何海寧,王杰斌,張彥軍

(1.甘肅省商業科技研究所有限公司,甘肅蘭州 730010;2.甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司,甘肅蘭州 730010)

有機磷是結構中含有酯鍵的一類化合物,因其種類多、易降解、殘留時間短而廣泛應用于農作物病蟲害防治中,其特點主要是高效性和廣譜性[1-2]。有機磷通過機體乙酰膽堿途徑引起中樞神經系統紊亂,導致機體無法正常運轉;有機磷化合物也可通過非膽堿酯酶抑制機制影響機體的神經系統,使機體產生認知功能障礙[3-4]。雖然大多數有機磷農藥殘留期短、殘留量少,但是有少數具有高毒和劇毒特性,如甲胺磷、對硫磷、甲拌磷等。馬雯等[5]研究表明,長期接觸低劑量的有機磷化合物會對人體產生生殖毒害和致癌的危害。因此,避免有機磷農藥對機體健康的危害至關重要。

啤酒是世界上僅次于水和茶的第三大飲料[6-9]。啤酒的生產過程是以大麥、玉米等糧食作物為主要原料,加入啤酒花作為輔料,經過酵母發酵釀制而成[10-12]。Tomonori等[13]和Simn等[14]在文章中指出,加入啤酒花的啤酒中農藥殘留量顯著高于未加入啤酒花的啤酒,說明啤酒中的農殘有來自于輔料中殘留。由于在啤酒釀造過程中原料和輔料中殘留的農藥難以徹底清洗干凈,部分農藥有存在于啤酒中的風險[15-18],對消費者的身體健康造成直接或潛在的危害[19]。因此,加強對啤酒中農藥殘留的檢測具有重要意義。

目前,國內外有機磷農殘檢測方法有氣相色譜法(Gas Chromatography,GC)、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、氣相色譜-質譜聯用法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)、高效液相色譜-質譜聯用法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry LC-MS)[20-22]。對于HPLC法,大多數有機磷化合物對紫外光吸收不強,靈敏度不高,因此該方法對有機磷農殘檢測種類有較大限制,制約了其應用;GC-MS法和HPLC-MS法在檢測有機磷農殘時準確度和靈敏度都能夠滿足,但是其儀器昂貴,成本較高,且需要非常專業的人員維護,也不宜應用于基層企業?；诖?針對大多數有機磷化合物的性質,其受熱易氣化、熱穩定性好,適用于GC法檢測,且GC法前處理操作簡便,分析速度快、靈敏度高[23-24],滿足市場上農藥殘留的監督檢測。啤酒中無機化合物成分較為單一,有機磷化合物在弱酸性環境中穩定性良好[25-27],因此本方法用酸化乙腈提取啤酒中的有機磷化合物,過針孔濾膜后GC法測定,以期探索一種前處理操作簡單、試劑消耗量少、回收率好的檢測方法,應用于市場上不同品類啤酒中有機磷農藥殘留的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16種有機磷農藥標準品:敵敵畏、滅線磷、甲拌磷、特丁硫磷、二嗪磷、樂果、甲基毒死蜱、甲基對硫磷、毒死蜱、對硫磷、水胺硫磷、甲基異柳磷、丙溴磷、甲基硫環磷、硫環磷、三唑磷 純度均≥96%,天津阿爾塔科技有限公司;乙腈、乙酸乙酯 色譜純,北京百靈威科技有限公司;冰乙酸 色譜純,國藥集團化學試劑有限公司;丙酮 色譜純,西隴科學股份有限公司;二氯甲烷 色譜純,山東禹王實業有限公司化工分公司;氯化鈉、無水硫酸鈉 分析純,天津市大茂化學試劑廠;啤酒試樣 購自當地市場。

7890B氣相色譜儀,配FPD檢測器 安捷倫科技有限公司;WondaCAP 17色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm) 日本島津技邇(上海)商貿有限公司;YP402N電子天平 上海精密科學儀器有限公司;CF16RXⅡ低溫冷凍高速離心機 上海安亭科學儀器廠;VG3S25渦旋振蕩器 北京東方開物科學器材有限公司;SB25-12D超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;KYC-100B空氣恒溫搖床 上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 前處理方法 取出冷藏保存的啤酒試樣,倒適量于大燒杯中,放至于500 W的超聲波儀超聲10 min,以除去二氧化碳。量筒量取5 mL試樣于50 mL聚丙烯刻度離心管中,準確加入10 mL 1%酸化乙腈(V冰乙酸∶V乙腈=1∶99),超聲提取10 min,期間在超聲波清洗機中放入冰袋,控制水溫不高于40 ℃,為使農藥提取更完全,360 r/min搖床再提取20 min;加入4 g氯化鈉,渦旋0.5 min,3000 r/min離心30 s;取上層有機相通過填有1 cm高的無水硫酸鈉注射筒和0.22 μm有機尼龍針式濾器至進樣瓶,待GC分析。

1.2.2 標準工作液的配制 準確吸取一定體積的16種有機磷農藥標準品,用1%酸化乙腈稀釋于10 mL容量瓶中,各個農藥標準儲備液濃度為1.00 mg/L,于-4 ℃冰箱中儲存,用1.2.1方法處理的陰性啤酒樣液配制標準工作溶液,濃度依次為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15 mg/L。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:WondaCAP 17(30 m×0.32 mm×0.25 μm);程序升溫條件:100 ℃保持2 min,25 ℃/min升至150 ℃,8 ℃/min升至240 ℃,保持5 min;載氣:N2(純度99.999%),流量:3.5 mL/min(恒流模式);燃氣:H2(純度99.999%);進樣口溫度:220 ℃;進樣方式:不分流進樣,進樣量:1 μL;檢測器溫度:250 ℃。

1.2.4 準確度與精密度 在陰性啤酒試樣中加三個不同濃度水平的16種有機磷混標,每個濃度水平做三個平行,用1.2.1處理加標試樣后上機測試,計算其平均回收率和RSD。

1.3 數據處理

用Execl計算測試數據平均回收率和RSD,用GraphPad Prism 5軟件生成測試數據的平面柱形圖和標準偏差(Standard Deviation,SD)。

2 結果與分析

2.1 啤酒基質中16種有機磷農藥殘留混標色譜譜圖

用1.2.2處理的陰性啤酒樣液按1.2.3配制標準工作溶液,在1.2.4氣相色譜條件下上機測試,得到16種有機磷農藥混標色譜譜圖,如圖1所示。

圖1 啤酒基質中16種有機磷農藥殘留混標氣相色譜譜圖Fig.1 Mixed standard gas chromatogram of16 kinds of OPs pesticide residues in beer注:1:敵敵畏；2:滅線磷;3:甲拌磷;4:特丁硫磷;5:二嗪磷;6:樂果;7:甲基毒死蜱;8:甲基對硫磷;9:毒死蜱;10:對硫磷;11:水胺硫磷;12:甲基異柳磷;13:丙溴磷;14:甲基硫環磷;15:硫環磷;16:三唑磷。

2.2 試樣前處理優化

2.2.1 提取試劑的選擇 按1.2.1,在陰性啤酒試樣中外部加標,使得上機樣液濃度為0.03 mg/L,考察丙酮、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷四者的提取效果。如圖2所示,不同有機磷化合物在氣相色譜FPD檢測器峰面積大小可知,乙腈作為提取試劑,16種有機磷農藥在氣相色譜儀器上響應最好。丙酮作為提取溶劑,有機磷農藥整體響應沒有乙腈好,而且丙酮提取基質中的糖類和色素比較多,容易堵塞進樣口;乙酸乙酯作為提取溶劑,提取的脂溶性雜質比較多,進樣后對色譜柱損耗較大;二氯甲烷是非水溶性的,提取效果不是很理想;相比前三者,乙腈作為提取溶劑避免了提取到過多的糖類、色素和脂溶性化合物,且水溶性良好,更適用于啤酒中有機磷農藥的提取。

圖2 啤酒中16種有機磷農藥分別經乙腈、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷提取上機檢測響應值Fig.2 The response values of 16 kinds of OPs pesticides in beer were extracted by acetonitrile,acetone,ethyl acetate and dichloromethane

2.2.2 乙腈的酸化 按1.2.1處理方法,在陰性啤酒試樣中外部加標,使得上機樣液濃度為0.03 mg/L,考察不同酸化程度的乙腈對有機磷化合物的提取效果。相較于中性環境,在弱酸性介質中,有機磷化合物的降解速率更慢、穩定性更好;如果酸性太強,化合物在分離檢測過程中,其無機酸不易氣化,易附著于氣相色譜儀進樣口和色譜柱固定相上,對其有不同程度的損壞并減短使用壽命,尤其是色譜柱。由圖3知,隨著乙酸量的增加,有機磷回收率增加,但是乙酸量超過1.0%后,回收率不但無明顯增加,反而有些有機磷的回收率下降了,因此選擇乙酸量為1.0%的乙腈作為啤酒中有機磷農殘提取溶劑,并且經過多次進樣未發現對進樣口和色譜柱有損壞。

圖3 不同酸化程度的乙腈提取啤酒中16種有機磷農藥回收率Fig.3 The recovery rate of 16 kinds of OPs pesticides from beer by acetonitrile extraction with different acidification degrees

2.2.3 酸化乙腈加入量的選擇 按1.2.1方法,在陰性啤酒試樣中外部加標,使得上機樣液濃度為0.03 mg/L,考察1%酸化乙腈不同加入量的提取效果。分別用5、8、10、15、20 mL的酸化乙腈進行提取,由圖4知,加入10 mL酸化乙腈提取時,16種有機磷回收率72.33%～108.67%,可適用于啤酒樣品中有機磷的檢測;用5和8 mL酸化乙腈提取有機磷農藥時,樂果、丙溴磷和甲基硫環磷的回收率低;用15和20 mL酸化乙腈提取有機磷農藥時,16種有機磷農藥回收率較10 mL提取沒有明顯提高;因此,取5 mL啤酒試樣分析時,最佳條件為10 mL 1%酸化乙腈。

2.3 線性范圍和檢出限

按1.2.2方法配制16種有機磷農藥混合標準工作液,在氣相色譜儀平衡至基線穩定后,進一針溶劑空白,以檢測目標物的儀器方法運行30 min,以3倍信噪比的峰面積分別帶入不同化合物校正曲線,求得儀器檢出限,10倍信噪比為儀器定量限;將儀器檢出限和定量限按1.2.1處理過程推導出該檢測方法的檢出限和定量限(見表1)。

由表1可知,本檢測方法16種有機磷農藥化合物在啤酒中的檢出限為0.0040～0.0190 mg/L,定量限為0.0132～0.0627 mg/L。

圖4 不同體積的1%酸化乙腈提取啤酒中16種有機磷農藥回收率Fig.4 The recovery rate of 16 kinds of extraction of OPs pesticides from beer by 1% acidified acetonitrile with different volumes

表1 16種有機磷線性方程和相關系數Table 1 16 Kinds of linear equations of OPs and coefficients

2.4 加標回收率和精密度實驗

按1.2.4方法,試樣加標濃度水平分別為0.03、0.05和0.08 mg/L,每個濃度水平做六個平行樣,用1.2.1處理后上機測試,結果見表2。

表2 16種有機磷回收率和RSD Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of 16 kinds of OPs

由表2可知,啤酒中添加三個濃度水平的16種有機磷農藥化合物,其回收率在72.33%～113.00%之間,RSD在0.52%～9.92%之間,依據GB/T 27404-2008附錄F,其回收率和RSD均符合要求,能夠滿足啤酒中以上16種有機磷農藥殘留的檢測。

2.5 實際樣品檢測

在市場上隨機購買十種不同種類的啤酒,按1.2.1處理后上氣相色譜儀檢測,檢測結果見表3。

表3 實樣測試結果Table 3 Test results of actual samples

通過查閱食品安全國家標準《GB 2763-2016食品中農藥最大殘留限量》[28]知,啤酒產品以及其以上16種有機磷農藥的檢測暫無檢驗標準;因此,本方法的建立在10種啤酒實際樣品的檢測中(表3),未檢出以上有機磷農藥。

3 結論

在5 mL陰性啤酒中外部加標,用10 mL 1%酸化乙腈提取后上機檢測,通過分析知該檢測方法操作過程簡單、試劑使用量小,線性范圍0.01～10.0 mg/L,檢出限0.0040～0.0190 mg/L,定量限0.0132～0.0627 mg/L,檢測范圍能夠滿足啤酒中以上16中有機磷農殘的檢測;方法回收率較高,在72.33～113.00%,RSD在0.52～9.92%,檢測數據穩定性好;實際樣品檢測結果均為未檢出;因此,該檢測方法適合于市售啤酒中以上16種有機磷農藥殘留的檢測。