基于多元統計方法分析陳釀條件對浙江玫瑰醋香氣成分的影響

穆曉靜,方冠宇,蔣予箭

(浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江 杭州 310018)

陳釀是食醋色澤、香氣、體態形成的重要環節,近年來對食醋、酒類等發酵性食品陳釀的研究多集中在人工催陳技術上,包括臭氧催陳[1]、微波催陳[2]、紅外線催陳[3]、超聲波催陳[4]、超高壓催陳[5]等,由于這些人工催陳技術存在一定弊端,還沒有一種高效、安全、穩定、低成本的技術應用到大規模生產中,自然陳釀仍在沿用。溫度是影響自然陳釀的一個重要因素,高本杰[6]研究了溫度對高純度白酒后熟過程風味的影響,結果表明適當增加溫度可加快白酒的老熟;王程成[7]研究表明溫度對風味物質葫蘆巴內酯在黃酒陳釀過程中的形成起到了決定性的作用;黃文韜[8]將山西老陳醋新醋分別在低溫和高溫下陳釀,結果表明高溫條件下,酯化反應、氧化反應和羰氨反應均較快,有利于后熟。

浙江玫瑰醋因其色澤鮮亮透徹,酸味柔和協調,酸中帶甜成為食醋中的上乘佳品[9-10]。過去受氣候的影響和發酵設備的限制,浙江玫瑰醋的生產形成了春投料、夏發花、秋發酵、冬陳釀的固定模式,陳釀過程多在冬季進行且占地面積大,陳釀周期長導致資金周轉慢。近幾年隨著發酵設備改進[11],玫瑰醋實現了一年多次生產,發酵結束后需要幾個月甚至1～3 a的陳釀方可食用。目前有關陳釀條件對玫瑰醋陳釀過程中風味物質的影響研究較少,實際生產中對陳釀效果的判斷多以經驗為主。

陳釀溫度和陳釀時間是影響陳釀過程中玫瑰醋香氣成分變化的2 個重要因素,香氣成分是衡量浙江玫瑰醋質量的重要指標,本研究就現有的自然陳釀技術,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)技術對不同溫度和時間下陳釀的浙江玫瑰醋中揮發性成分進行測定,再結合主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)等多元統計分析方法對測定結果進行統計分析,將溫度、陳釀時間對玫瑰醋中風味物質的影響用科學的數據進行解釋分析,以期為工業生產中玫瑰醋的陳釀提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

浙江玫瑰醋醋樣:鮮醋(未經陳釀)分別由紹興至味食品有限公司、湖州老恒和釀造有限公司、新昌縣天姥食品有限公司、浙江五味和食品有限公司提供,醋樣均為浙江玫瑰醋原釀汁,陳釀前總酸均為6.8 g/100 mL,實驗室里完成貯藏,樣品具體信息見表1。

2-乙基丁酸(色譜純) 廣州市江順化工科技有限公司;無水乙醇(分析純) 無錫市展望化工試劑有限公司;NaOH標準溶液(0.05 mol/L)(分析純) 西隴科學股份有限公司。

表1 醋樣信息Table 1 Detailed information about vinegar samples tested in this study

1.2 儀器與設備

BCD-215DK恒溫培養箱 青島海爾股份有限公司;SPX-250B-Z冰箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;DVB/CAR/PDMS萃取頭(50/30 μm) 美國Supelco公司;7890A-5975C GC-MS聯用儀 美國Agilent公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME條件

取樣品12.5 mL置于20 mL頂空瓶中(檢測前將樣品放4 ℃冰箱中使樣品溫度一致),再加100 μL內標物(2-乙基丁酸),用帶有硅橡膠隔墊的瓶蓋密封。將頂空瓶放入50 ℃水浴鍋平衡30 min,然后將己在240 ℃進樣口老化至無雜峰的萃取頭插入頂空瓶中距離液面1 cm處,50 ℃吸附30 min,取出后插入GC進樣口,240 ℃解吸2 min,進行GC-MS分析。

1.3.2 GC條件

色譜柱:DB-WAX色譜柱(60 m×0.25 mm,0.5 μm);進樣口溫度:240 ℃,不分流進樣,恒流模式,柱流速:1 mL/min;柱溫:35 ℃保持3 min,以3 ℃/min升到220 ℃,保持10 min。

1.3.3 MS條件

離子源:電子電離源;離子源溫度:230 ℃;四極桿溫度:150 ℃;質量掃描范圍:33～500 u;質譜譜庫檢索使用NIST 14數據庫。

1.3.4 樣品香氣成分半定量分析

采用內標法對風味物質進行半定量分析,以159.18 mg/L 2-乙基丁酸(用體積分數20%乙醇溶液配制)為內標物[12]。

1.4 數據分析

用Origin 9和Excel對數據進行處理和統計,IBM SPSS Statistics 22比較香氣揮發物之間的差異性,結果表示為,P＜0.05,差異顯著;用SIMCA 14.2軟件進行PCA,在PCA的基礎上,根據樣品的聚類趨勢,對樣品人為歸類后進行OPLS-DA,并繪制PCA得分圖、HotellingT2分布圖、OPLS-DA得分圖和模型置換驗證圖、S-plot圖。

2 結果與分析

2.1 不同陳釀條件下醋樣香氣成分組成及質量濃度比較

香氣是衡量浙江玫瑰醋品質的一項重要指標,然而剛釀造好的新鮮玫瑰醋口感生硬,酸味刺激,雜味較濃,香氣單薄,不宜食用,因此要經過陳釀環節,增加食醋風味物質使其香氣協調。本實驗采用SPME-GC-MS技術對不同條件下陳釀的16 種醋樣中揮發性風味物質進行檢測,所得GC-MS檢測結果通過計算機NIST 14譜庫和人工檢索處理,選出匹配度不小于80%的化合物并參考文獻[13-14]進行定性定量分析,結果見表2。

表2 不同陳釀條件下浙江玫瑰醋中揮發性成分質量濃度Table 2 Volatile components in Zhejiang rosy vinegar under different aging conditions μg/L

續表2 μg/L

續表2 μg/L

圖1 醋樣在不同陳釀條件下的各類揮發性成分總量比較Fig. 1 Comparison of the total content of each class of volatiles in rosy vinegar samples under different aging conditions

每個醋樣中質量濃度最高的醇類均為苯乙醇,這種物質具有清淡玫瑰花香,目前被鑒定為酒中重要的芳香族化合物[15],也是玫瑰醋中貢獻率較大的一種醇類物質,其次為乙醇和異戊醇。由圖1可以看出,高溫陳釀5 個月、常溫陳釀2.5 a比低溫、常溫陳釀5 個月的醋樣醇類總質量濃度顯著降低(P＜0.05),劉源等[16]研究表明,在陳釀過程中醇類被氧化為醛、酸,以及與酸類物質發生酯化反應,使醇類質量濃度降低,尤其是乙醇質量濃度。乙醇質量濃度的降低使食醋的口感變得綿軟柔和[17]。本研究表明溫度越高,醇類物質下降越明顯。

每個醋樣中檢測出7 種酸類化合物,除了主體乙酸外,質量濃度較高的為異丁酸、異戊酸和辛酸,其中異丁酸具有牛奶香、酸味香、水果香和脂肪香的組合香氣,賦予浙江玫瑰醋較好風味[18]。由表2和圖1可以看出,陳釀溫度和時間對玫瑰醋中異丁酸質量濃度影響不顯著(P＞0.05),對乙酸影響顯著(P＜0.05)。陳釀溫度越高,時間越久,乙酸質量濃度越低,總酸質量濃度也越少,該結果與黃文韜[8]研究結果一致。說明醋經陳釀后,伴隨著酯化反應和揮發酸的揮發,總酸質量濃度降低,但剩余的不易揮發酸使食醋酸味更加柔和,高溫更有利于反應的進行。

酯類物質是醋樣中檢測到的種類最多、質量濃度最高的風味物質。質量濃度較高的酯類有乙酸乙酯、2-苯乙基乙酸酯、乙酸異戊酯、二乙基丙二酸乙酯。陳釀過程中酯類的形成途徑主要是在酯酶的催化下由酸類物質與相應的醇類物質發生酯化反應,或是乙酰輔酶A在醇?；D移酶的作用下和相應的醇類縮合而成[19-20],絕大多數的酯類具有花香、果香和蜂蜜香,是大多數食醋風味的重要來源。由圖1可知,高溫5 個月陳釀醋中酯類物質質量濃度比低溫和常溫陳釀相同時間的醋顯著降低(P＜0.05),常溫2.5 a陳釀醋中酯類物質質量濃度略有下降,該結果說明溫度對玫瑰醋中酯類物質質量濃度影響較大,溫度越高,酯類物質減少量越大。

醛、酮、酚及其他物質在醋樣中檢測到質量濃度及種類較少,酚類最少,但酚類物質的氣味閾值較低,構成玫瑰醋特有的香氣[21-22]。苗志偉等[23]研究表明,糠醛、3-羥基-2-丁酮、丁二酮等物質對山西老陳醋特征香氣起重要作用,這些物質多在陳釀過程中產生。由表2看出,高溫5 個月陳釀醋和常溫2.5 a陳釀醋中這些物質質量濃度顯著增加(P＜0.05),其中糠醛主要來自于美拉德反應和酸催化條件下的糖降解反應,是食品中褐色的主要來源[24],影響著玫瑰醋的色澤。該結果表明高溫陳釀更有利于糠醛、3-羥基-2-丁酮、丁二酮等物質的形成,為玫瑰醋提供特殊風味。

2.2 多元統計分析

2.2.1 基于PCA對不同陳釀條件下玫瑰醋的區分

近些年,隨著多元統計分析方法的推廣,越來越多的統計分析方法應用于同一物質不同品種間的化學識別[25-26]、香氣指紋圖譜的建立[27-28]、特征性香氣成分分析[29]等方面的研究。其中PCA可大大降低數據的復雜度,并對數據進行可視化處理[30]。由于本實驗所測樣品的風味物質復雜且樣品量較多,通過PCA可從數據之間錯綜復雜的關系中找到一些主成分,從而有效利用大量統計數據進行分析,因此采用PCA對測定結果進行分析,提取4 個主成分,累計貢獻率為64.26%,基本可以反映整體樣本信息。

圖2 PCA得分圖（a）和Hotelling T2分布圖（b）Fig. 2 PCA score plot (a) and Hotelling T2 value range plot (b)

由圖2a可以看出,16 種醋樣呈現極明顯的區域分布特性,被分為4 類:A類醋樣(#1、#2、#3、#4)均為0～5 ℃低溫下陳釀5 個月的玫瑰醋;B類醋樣(#5、#6、#7、#8)均為常溫下陳釀5 個月的玫瑰醋;C類醋樣(#9、#10、#11、#12)均為高溫下陳釀5 個月的玫瑰醋;D類醋樣(#13、#14、#15、#16)均為常溫下陳釀2.5 a的玫瑰醋。說明不同陳釀條件下的玫瑰醋風味物質有明顯差異,但由于PCA是無監督分析模型,不能去除未控制變量對數據造成的影響,從而使部分不同條件下陳釀的玫瑰醋(如#12、#13)區分不明顯,但由圖2b可看出,所有樣品均在95% Hotelling T2置信區間內,未發現超出該置信區間的樣本,可進一步對樣品中風味物質進行OPLS-DA。

2.2.2 基于OPLS-DA對不同陳釀條件下玫瑰醋的區分

圖3 OPLS-DA得分圖（a）和OPLS-DA模型置換驗證圖（b）Fig. 3 Score plot of OPLS-DA (a) and permutation test plot (b)

OPLS-DA是在PCA基礎上再進行計算分析的一種方法,但相比于PCA,OPLS-DA屬于有監督分析,可通過預設分類,盡可能去除未控制變量對數據造成的影響,可進一步挖掘數據信息,同時可以量化特征風味物質造成樣品之間差異的程度[31-32]。本實驗根據PCA的聚類趨勢,將同一條件下陳釀醋作為Y變量進行OPLS-DA。

由圖3a可看出,分別在低溫和常溫下陳釀5 個月的醋樣(A類和B類)極其靠近,但是這2 類醋樣遠離常溫陳釀2.5 a的D類醋,說明D類醋與A、B類成分相差較大;而在高溫下陳釀5 個月的C類醋與D類醋靠近,表明在高溫下短時間陳釀的玫瑰醋成分較接近常溫下長時間陳釀的玫瑰醋。為驗證該OPLS-DA模型的可靠性,對樣本順序進行隨機置換,將建立OPLA-DA模型時定義分類Y的變量順序隨機排列200 次,得到的Q2值作為衡量模型是否過擬合的標準[33]。如圖3b所示,R2和Q2回歸線的斜率均大于1,且Q2回歸線的截距小于0,結果表明該OPLS-DA模型可靠,未出現過擬合現象,可用于對實驗中的16 種玫瑰醋樣判別分析。因此用該模型進一步對不同玫瑰醋醋樣中重要香氣成分進行分析。

2.2.3 不同陳釀條件下玫瑰醋中重要香氣成分差異分析

圖4 OPLS-DA S-plot圖Fig. 4 S-plot of OPLS-DA

為可視化OPLS-DA模型中的變量,分析造成2 類樣品存在差異的標志性物質,S-plot圖可得到變量投影重要性[34]。根據2 類存在差異的樣品中揮發性物質含量數據,通過SIMCA軟件做出S-plot圖。為分析不同陳釀年份的玫瑰醋中重要香氣成分差異,將B類醋與D類醋進行對比,S-plot見圖4a。為分析不同陳釀溫度對玫瑰醋中重要香氣成分的影響,進一步對不同陳釀溫度下的玫瑰醋進行對比,由于A類醋和B類醋樣差異極小,因此只選擇其中之一A類醋與C類醋進行對比,S-plot圖見圖4b。

OPLS-DA S-plot圖S形左下方和右上方2 個角上的變量是區分兩組樣品的主要風味物質。由圖4a得出,D8(糠醛)、E8(2,3-丁二酮)、E5(3-羥基-2-丁酮)、C1(乙酸乙酯)、A3(苯乙醇)、E6(3-乙?；?2-丁酮)等是造成B類和D類醋樣呈現差異的主要物質;玫瑰醋陳釀過程中糠醛、2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、乙酸乙酯、苯乙醇、3-乙?；?2-丁酮等物質含量變化較大。

由圖4b看出,C1(乙酸乙酯)、E8(2,3-丁二酮)、E6(3-乙?；?2-丁酮)、D8(糠醛)是造成A類與C類醋差異顯著的主要風味物質,說明玫瑰醋陳釀過程中溫度對這幾種物質影響較大。

為對每種陳釀條件的浙江玫瑰醋中重要香氣成分分析,做出OPLS-DA因子荷載圖,可反映每一個變量在得分圖上的貢獻。

圖5 OPLS-DA因子荷載圖Fig. 5 Loading factors plot of OPLS-DA

從圖5可以看出,E3(4-甲基-2-戊酮)、C19(2-甲基巴豆酸異戊酯)、C11(2-乙基丁酸-2甲基丙基酯)、A1(乙醇)、C1(乙酸乙酯)等物質是低溫后熟玫瑰醋(#1、#2、#3、#4)和常溫后熟玫瑰醋(#5、#6、#7、#8)中的特征性風味物質;C16(3-乙氧基乙酸丙酯)、C18(2-乙基丁酸-庚-4-基酯)、C30(2-乙基丁酸-3-甲基-苯基酯)、C37(鄰苯二甲酸二庚酯)等是高溫后熟玫瑰醋的重要香氣物質,常溫陳釀2.5 a的玫瑰醋(#13、#14、#15、#16)主要香氣成分是C26(乙酸苯甲酯)、F2(2,4-二叔丁基苯酚)、D8(糠醛)、E8(2,3-丁二酮)、B2(異丁酸)、D10(2-羥基苯甲醛)等風味物質。

綜上所述,溫度對玫瑰醋的陳釀后熟影響較大,冷藏后熟的玫瑰醋和常溫后熟的風味接近,但與高溫下陳釀相同時間的玫瑰醋風味差異較大,高溫陳釀5 個月的玫瑰醋風味接近常溫下陳釀2.5 a的玫瑰醋,說明高溫下玫瑰醋中的物質發生各類化學反應較快,更有利于風味物質的形成,因此可推斷高溫陳釀對浙江玫瑰醋有催陳作用。

3 結 論

采用SPME-GC-MS技術對不同陳釀條件下的浙江玫瑰醋中揮發性成分醇類、酸類、酯類、醛類、酮類、酚類進行定性半定量檢測,結果表明,高溫(35～40 ℃)陳釀5 個月的玫瑰醋和常溫下陳釀2.5 a的玫瑰醋中醇類、酸類、酯類等均顯著低于低溫(0～5 ℃)、常溫(20～25 ℃)陳釀5 個月的玫瑰醋,但酮類、醛類總含量普遍偏高,其中美拉德反應產物糠醛明顯增多。

對數據進一步采用PCA、OPLS-DA等多元統計分析,結果看出PCA、OPLS-DA均可對不同陳釀條件的浙江玫瑰醋進行有效區分,其中高溫陳釀5 個月的玫瑰醋和常溫陳釀2.5 a的玫瑰醋靠得較近,低溫陳釀5 個月和常溫陳釀5 個月的玫瑰醋靠得近,說明高溫陳釀可縮短陳釀周期。

通過OPLS-DA S-plot圖得出:1)玫瑰醋陳釀過程中糠醛、2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、乙酸乙酯、苯乙醇等物質含量變化較大;2)玫瑰醋陳釀過程中溫度對乙酸乙酯、苯甲醛、2,3-丁二酮、糠醛等物質影響較大。

OPLS-DA荷載圖得出:4-甲基-2-戊酮、2-甲基巴豆酸異戊酯、2-乙基丁酸-2甲基丙基酯、乙醇、乙酸乙酯等物質是低溫陳釀玫瑰醋和常溫陳釀玫瑰醋中的特征性風味物質;3-乙氧基乙酸丙酯、2-乙基丁酸-庚-4-基酯、2-乙基丁酸-3-甲基-苯基酯、鄰苯二甲酸二庚酯等是高溫陳釀組玫瑰醋的主要呈味物質,常溫陳釀2.5 a的玫瑰醋主要呈味物質是乙酸苯甲酯、2,4-二叔丁基苯酚、糠醛、2,3-丁二酮、異丁酸、2-羥基苯甲醛等風味物質。